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利用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定烏干達(dá)紅薯（甘薯）種質(zhì)的遺傳多樣性 芭芭拉M. Zawedde?Marc Ghislain? Eric Magembe ? Geovani B. Amaro ? 麗貝卡格魯梅特?吉姆漢考克 收到日期：2014年4月7日/接受日期：2014年9月1日/網(wǎng)上發(fā)布：2014年9月17日 斯普林格科學(xué)+商業(yè)媒體Dordrecht 2014 摘要有關(guān)作物品種遺傳多樣性和結(jié)構(gòu)的知識可以幫助做出更好的保護(hù)決策，并指導(dǎo)作物改良工作。 利用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行多樣性分析以評估烏干達(dá)甘薯的遺傳多樣性水平，并評估烏干達(dá)種質(zhì)與從肯尼亞，坦桑尼亞，加納，巴西和秘魯獲得的一些基因型之間的遺傳關(guān)系。 共有260個(gè)甘薯品種用93個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行鑒定。 烏干達(dá)收藏展示不同的地方品種，以及從不同農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)獲得的基因型之間的遺傳多樣性水平非常低（3％）。 東非基因型之間觀察到的遺傳多樣性水平很低（6％）; 然而來自各種來源的收集物中存在獨(dú)特的等位基因。 成對比較遺傳分化表明烏干達(dá)種質(zhì)與坦桑尼亞，加納，巴西和秘魯?shù)钠贩N差異顯著（P <0.001）。 來自烏干達(dá)各個(gè)農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)和其他全球區(qū)域的人群中獨(dú)特的等位基因以及區(qū)域多樣性模式表明，應(yīng)該努力進(jìn)一步收集和更加深入地描述種質(zhì)。 關(guān)鍵詞表征á作物育種áIpomoea batatasá分子標(biāo)記áSSR 介紹 具有不同環(huán)境適應(yīng)能力的作物品種的種質(zhì)資源集合既是未來作物改良的基因來源，也是農(nóng)民的關(guān)鍵資源。 大多數(shù)重要全球糧食作物的遺傳多樣性水平最高的地區(qū)是南部，這里通常有起源的作物中心，而且由于長期選擇農(nóng)民而出現(xiàn)多樣性中心（糧農(nóng)組織 2008). 在東部非洲收獲的重量方面，甘薯Ipomoea batatas（L.）Lam。是第五重要的糧食作物（糧農(nóng)組織 2012）。 葡萄牙探險(xiǎn)家于16世紀(jì)將紅薯從南美引入東非邊界（Zhang et al。 2004）。 在秘魯Chilca峽谷的洞穴中發(fā)現(xiàn)了最古老的甘薯遺跡，其歷史可追溯到8,000年前（Lebot 2010）。 然而，根據(jù)相關(guān)物種之間的形態(tài)關(guān)系，起源中心似乎位于墨西哥的尤卡坦半島和委內(nèi)瑞拉的奧里諾科河之間（奧斯汀 1977）。 在該地區(qū)也發(fā)現(xiàn)野生種Batatas，被認(rèn)為是公認(rèn)的祖先和栽培甘薯的野生親緣種（Andersson and de Vicente 2010）。 來自世界不同地區(qū)的種質(zhì)資源遺傳多樣性模式的評估導(dǎo)致了中國，東南亞，新幾內(nèi)亞和東非是次要的多樣性中心的建議（日元 1982; 奧斯汀 1983). 烏干達(dá)是撒哈拉以南非洲地區(qū)人均生產(chǎn)量最高的地區(qū)，種植了大量不同種類的甘薯品種。 2005年，全國甘薯項(xiàng)目收集了1300多個(gè)地方品種，這些品種使用形態(tài)學(xué)方法來確定遺傳多樣性水平，其中946個(gè)被發(fā)現(xiàn)是形態(tài)上不同的基因型（Yada et al。 2010a）。 這種高水平的多樣性主要?dú)w因于甘薯的同種異體和六倍體性質(zhì)（Lebot 2010），以及農(nóng)民偏好的變化（Veasey et al。 2008）。 藤蔓繁殖的方法也通過保持栽培品種的多樣性間接起作用。 關(guān)于現(xiàn)有作物品種遺傳多樣性和結(jié)構(gòu)的知識可以有助于做出更好的保護(hù)決策，并有助于直接育種計(jì)劃。 作物多樣性的表征可以通過形態(tài)學(xué)和分子學(xué)工具來實(shí)現(xiàn)。 形態(tài)特征是評估多樣性的重要的第一步; 然而，僅依賴于形態(tài)學(xué)表征（包括低水平的多態(tài)性，低重復(fù)性，某些性狀的晚期表達(dá)）存在主要限制; 表型可塑性和平行進(jìn)化（Karuri et al。 2010; 亞達(dá)等人。 2010b）。 許多分子標(biāo)記包括隨機(jī)擴(kuò)增的多形態(tài)DNA（RAPD），限制性片段長度 多態(tài)性（RFLP），擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP），微衛(wèi)星或簡單序列重復(fù)序列（SSR），單核苷酸多態(tài)性（SNPs）已經(jīng)被開發(fā)并被用于補(bǔ)充形態(tài)表征。 在作物中選擇任何特定的DNA標(biāo)記在很大程度上取決于研究的目的，可用的資源和技術(shù)技能（Otoo et al。 2009). 在甘薯研究中，許多分子標(biāo)記已被用于研究作物的遺傳多樣性，包括RAPD（Connolly et al。 1994; Gichuki等人 2003; 他等人。 2006），DNA擴(kuò)增指紋圖譜（DAF）（He et al。 1995），AFLPs（Zhang et al。 2004，Elameen et al。 2008），簡單序列重復(fù)序列（ISSR）（Hu et al。 2003），微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)的選擇性擴(kuò)增（SAMPL）（Tseng et al。 2002）和SSRs標(biāo)記（Gichuru et al。 2006; Veasey等人。 2008）和微衛(wèi)星或SSR（Jarret和Bowen 1994; 布特勒等人。 1999; 胡等人。 2004; 亞達(dá)等人。 2010b; Tumwegamire等人 2011). 甘薯是一種六倍體（2n = 6x = 90）作物，據(jù)信來自幾種野生物種之間的天然雜交（Lebot 2010）。 關(guān)于六倍體甘薯的產(chǎn)生有三種假設(shè)：多倍體（Kobayashi 1983; Shiotani和Kawase 1987, 1989）; allo-autopolyp-loidy（Schafleitner et al。 2010）和allopolyploidy（奧斯汀 1977; 西山 1971; Srisuwan等人 2006; 高等人。 2011）。 當(dāng)使用分子標(biāo)記進(jìn)行種質(zhì)鑒定時(shí)，甘薯的六倍體性質(zhì)和其基因組構(gòu)成的復(fù)雜性造成挑戰(zhàn)（Lebot 2010）。 然而，已經(jīng)證明SSR標(biāo)記在揭示與六倍體幾內(nèi)亞山藥Dioscorea rotundata Poir的形態(tài)表征非常相似的遺傳關(guān)系中是有用的。 （Mignouna et al。 2003）和紅薯中多態(tài)性的檢測（Veasey et al。 2008）。 已發(fā)現(xiàn)少量SSR標(biāo)記（低至10對引物）可有效追蹤群體間特定等位基因的移動(dòng)（Lebot 2010），并區(qū)分人群中不同的個(gè)體（Yada et al。 2010b). 在烏干達(dá)，有兩項(xiàng)研究先前使用SSR標(biāo)記分析了烏干達(dá)甘薯種質(zhì)的遺傳多樣性。 一項(xiàng)研究集中于評估192個(gè)選定的優(yōu)良地方品種（高產(chǎn)，甘薯病毒病或鏈格孢病抗性或高干物質(zhì)含量），并得出結(jié)論，有190個(gè)不同的地方品種（Yada et al。 2010b）。 第二項(xiàng)研究使用同一系列的75個(gè)品種評估東非橙肉與白肉地方品種之間的遺傳關(guān)系，以及它們與來自中國，美國，巴布亞新幾內(nèi)亞和秘魯?shù)钠贩N之間的關(guān)系（Tumwegamire et al。 2011）。 他們發(fā)現(xiàn)，肯尼亞首先發(fā)展的橙色肉食類型與非非洲的橙色肉食類型不同，而東非的橙肉和白肉地方品種密切相關(guān)。 自1995年以來，國家育種計(jì)劃已經(jīng)發(fā)布了20個(gè)品種（Mwanga et al。 2011）。 大多數(shù)這些品種（Sowola和NASPOT1至11）是從18至24歲父母的雜交種的膨化種子中選擇的。 本研究的目的是利用SSR標(biāo)記來確定Ugan-s甘薯遺傳多樣性的結(jié)構(gòu)，以評估烏干達(dá)地方品種和釋放栽培品種之間的遺傳關(guān)系，并將其與來自其他地區(qū)的種質(zhì)相關(guān)聯(lián)世界。 這些信息可用于提出建議，以改進(jìn)并可能提高低成本甘薯多樣性的保護(hù)。 材料和方法植物材料 利用Namulonge國家作物資源研究所甘薯項(xiàng)目維護(hù)的收集數(shù)據(jù)庫，共選取了168個(gè)烏干達(dá)基因型，分為三類：對蟲害侵染的反應(yīng)（Muyinza et al。 2012）; 農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)（Yada et al。 2010a）; 和品種分類（Mwanga et al。 2011）。 從烏干達(dá)的五大紅薯種植農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)選取土地：北部地區(qū); 東部地區(qū); 中央?yún)^(qū)域; 西部地區(qū); 和南部地區(qū)。 為了確定它們與來自世界其他地區(qū)的基因型之間的遺傳關(guān)系，將烏干達(dá)基因型與來自其他甘薯種植的非洲國家，巴西和秘魯?shù)幕蛐瓦M(jìn)行比較。 從三個(gè)不同的polycross-es的膨大種子中選擇改良的栽培種，每個(gè)種子包含18到24個(gè)親本（Mwanga et al。 2003, 2009, 2011）。 種植材料的選定栽培種在篩房中生長2個(gè)月，將幼葉立即置于冰上并儲存在-80℃直到DNA提取。 DNA提取和簡單序列重復(fù)（SSR）擴(kuò)增 使用改進(jìn)的CTAB方法從200mg冷凍葉組織中分離基因組DNA（Doyle和Doyle， 1990），根據(jù)（Yada et al。 2010b）。 定量總共308個(gè)DNA樣品，稀釋至20ng /μl，并準(zhǔn)備用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。 在之前的甘薯研究中使用的31標(biāo)記的SSR引物對（Karuri et al。 2010; 亞達(dá)等人。 2010b; Tumwegamire等人 2011）進(jìn)行DNA擴(kuò)增測試，并且僅有19個(gè)SSR標(biāo)記（表1 1）被選中并用于本研究。 其他SSR標(biāo)記由于非特異性擴(kuò)增或單形性而被拒絕。 總反應(yīng)體積為10μl，其中含有11μl10X PCR緩沖液（10mM Tris-HCl pH 9.0,30mM KCl，1.5mM MgCl2），0.1μl凍干的5U /μlTaq DNA聚合酶，0.2μl10mM dNTP，0.5μl10μl引物，2.5μl20ng /μlDNA模板和5.7μl雙蒸水用于PCR。 PCR程序設(shè)置如下：94 LC 3分鐘進(jìn)行初始變性，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30秒，對于每個(gè)引物對在指定溫度下退火（表 1）并在72LC下聚合30秒，然后在72LC下最終延伸20分鐘。 針對每種DNA樣品制備擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，并使用ABI 3730毛細(xì)管測序儀（Applied Biosystems）進(jìn)行片段分析。 等位基因評分和數(shù)據(jù)分析 使用Genemapper v3.7軟件（Applied Biosystems）進(jìn)行峰檢測和片段大小估計(jì)。 AlleloBin軟件（Prasanth et al。 1997）被用于校正在PCR期間由于DNA聚合酶滑移導(dǎo)致的得分等位基因中的任何錯(cuò)誤（Schlotterer和Tautz 1992）。 使用以前用于描述多倍體多樣性的兩種數(shù)據(jù)編碼方法進(jìn)行分析（Esselink et al。 2004; 約根森等人 2008; Kloda等人 2008; Garc?'a-Verdugo等人。 2009; 桑普森和拜恩 2012）。 首先，使用ALS-Binary軟件（Prasanth和Chandra）將多位點(diǎn)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為每個(gè)個(gè)體存在/不存在等位基因的二進(jìn)制陣列 1997). 名稱 染料 主題 TAa 參考 IB-S07 6-FAM （TGTC）7 60 Benavides（unp。）b IB-R03 寵物 （GCG）5 58 Benavides（unp。） IB-16 VIC （GATA）4 59 Benavides（unp。） IB-13 NED （TTC）6 58 Benavides（unp。） J10A 寵物 （AAG）6 TD（57-62）Solis等人 （UNP。）c J175 VIC （AATC）4 TD（57-62）Solis等人 （UNP）。 IBCIP-9 6-FAM （CCA）2AC（ACC）6 TD（50-60） Yan?ez（2002) IBCIP-13 NED （GTC）2 TD（57-62） Yan?ez（2002) IB-R19 寵物 （CAG）5B TD（57-62） Benavides（unp。） BU691984 6-FAM （TGG）6 TD（57-62）Hu et al。 （2004) JB1809 VIC （CCT）6（CCG）6 TD（50-60）Solis等人 （UNP）。 IBSSR09 NED （GAA）5（GAG）3 TD（57-62）Hu et al。 （2004) IB-R08 寵物 （T3A）4 TD（50-60） Benavides 續(xù)表 名稱 染料 主題 TAa 參考 BU690708 6-FAM （CCG）5 TD（57-62）Hu et al。 （2004) 1B-S18 6-FAM （TAGC）4 TD（57-62） Benavides（unp。） IBCIP-1 6-FAM （ACC）7a中 TD（57-62） Yan?ez（2002) IBSSR07 寵物 （CT）7A（TC）4 TD（57-62）Hu et al。 （2004) IB-12 NED （CAG）5A TD（57-62） Benavides（unp。） 其次，MAC-PR（微衛(wèi)星DNA等位基因計(jì)數(shù)峰比）法（Esselink et al。 2004）被用來獲得每個(gè)多倍體個(gè)體的16個(gè)標(biāo)記的等位基因劑量。 MAC-PR方法利用GeneMapper軟件提供的峰值區(qū)域的定量值。 對于每個(gè)基因座，所有等位基因在成對組合中進(jìn)行分析以確定其在各個(gè)樣品中的拷貝數(shù)。 這是通過計(jì)算兩個(gè)等位基因一起發(fā)生的所有樣品中兩個(gè)等位基因的峰面積之間的比率來完成的。 獲得具有六種不同等位基因或三種不同等位基因的個(gè)體為分別計(jì)算單和雙拷貝劑量提供了基線。 二進(jìn)制數(shù)據(jù)被用來確定多態(tài)信息內(nèi)容（PIC），這是衡量每個(gè)標(biāo)記在區(qū)分由Weir制定的個(gè)體之間的有用性的度量（1996）為每個(gè)群體的遺傳多樣性包括多態(tài)位點(diǎn)數(shù)（P），多態(tài)還使用GenAlEx版本6.4進(jìn)行分子方差分析（AMOVA）以估計(jì)種群內(nèi)和種群間多樣性的總方差和分布。 還使用GenAlEx軟件計(jì)算了賴特的F統(tǒng)計(jì)量（FST，固定指數(shù)），以估計(jì)可由群體結(jié)構(gòu)解釋的遺傳變異量（Holsinger和Bruce 2009). 其中HI是亞群內(nèi)每個(gè)個(gè)體觀察到的平均雜合度，HT是隨機(jī)交配總?cè)后w中的期望雜合性。 FST的范圍可以從0.0（無分化）到1.0（完全分化，即固定用于不同等位基因的亞群）。 使用DARwin第5版（Perrier和Jacquemoud-Collet）評估種群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 2006）。 用Jaccard's從二進(jìn)制數(shù)據(jù)構(gòu)造相似性矩陣系數(shù)（Jaccard 1908）。 Jaccard系數(shù)= NAB/（NaΔNb），其中NAB是兩個(gè)個(gè)體a和b共享的等位基因數(shù)，Na樣本a和Nb是樣本b中等位基因的總數(shù)。 通過基于單體型頻率計(jì)算通常的歐幾里德距離矩陣來獲得種群之間的遺傳距離。 從該矩陣中，使用來自Saitou和Nei的相鄰連接方法（NJ）構(gòu)建樹狀圖1987）。 每個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要性通過引導(dǎo)原始矩陣的5,000個(gè)重復(fù)位點(diǎn)上的數(shù)據(jù)來評估。 我們使用未加權(quán)的配對組方法分析（UPGMA）檢查了個(gè)體之間的分層遺傳變異，如Sneath和Sokal（1973). 使用STRUCTURE版本2.3.3檢查個(gè)體和群體的聚類模式（Pritchard et al。 2000），據(jù)報(bào)道它具有生成種群結(jié)構(gòu)的能力（Prit-chard et al。 2009）。 使用每個(gè)個(gè)體的等位基因劑量（MAC-PR）數(shù)據(jù)，將個(gè)體概率地分配給基因簇（K）。 STRUCTURE程序運(yùn)行時(shí)沒有使用混合祖先模型的人口結(jié)構(gòu)的先驗(yàn)假設(shè)，并且推薦的隱性等位基因方法和等位基因頻率相關(guān)。 該分析用于確定是否可以在取樣的植物中確定生物相關(guān)簇，并建立起源于每個(gè)簇的個(gè)體基因組（Q）的比例。 對于所有的分析，馬爾科夫鏈蒙特卡羅（MCMC）參數(shù)被設(shè)置為50000次的老化時(shí)間，其中50,000次迭代。 使用Evanno等人描述的方法，對于每個(gè)K值（K設(shè)定為10），從20次重復(fù)運(yùn)行確定指示數(shù)據(jù)中真實(shí)簇?cái)?shù)量的最佳K值。 （2005）和特定數(shù)量增量K，其基于連續(xù)K值之間的數(shù)據(jù)的對數(shù)概率的變化率。 Evanno等人的方法的參數(shù) （2005）使用結(jié)構(gòu)收割機(jī)版本0.6.92（Earl和vonHoldt）計(jì)算 2012）。 不同運(yùn)行之間的相似性通過Jakobsson和Rosenberg（2007）在他們的計(jì)算機(jī)程序CLUMPP 1.1.2中使用。 該方法計(jì)算相似系數(shù)h0，它可以評估程序STRUCTURE的各個(gè)運(yùn)行的相似性。 使用計(jì)算機(jī)程序CLUMPP 1.1.2（Jakobsson和Jakob）確定了20個(gè)重復(fù)K值的最佳比對 許多這些群集與地方性。 值得注意的是（6/10）改良品種與肯尼亞品種卡卡梅加（Kakamega）組合在一起，該品種故意包含在本分析中，因?yàn)樗窃S多這些改良品種的已知母本。 基因型之間的遺傳關(guān)系 來自烏干達(dá)的農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)和從其他東非國家收集的品種 分子方差分析（AMOVA）表明，只有6％的遺傳變異是由不同來源解釋的 3）。 分析十六個(gè)微衛(wèi)星在來自八個(gè)預(yù)定義群體的228-甘薯基因型中總共產(chǎn)生了93個(gè)推測位點(diǎn)（表 4）。 在每個(gè)群體中觀察到平均70個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。 遺傳多樣性水平各不相同在不同的人群中。 烏干達(dá)大部分地區(qū)的人群中只有少數(shù)獨(dú)特的等位基因（1-4），除了西南地區(qū)，沒有。 坦桑尼亞栽培品種也有少數(shù)獨(dú)特的等位基因（4），但雜合度最高（D）。 總體而言，收集的樣品的雜合度（D）水平較低。 來自坦桑尼亞的栽培種與烏干達(dá)和肯尼亞的種群之間的顯著差異清楚地顯示在遺傳距離矩陣中（圖1）。. 烏干達(dá)基因型與從其他地區(qū)采集的品種之間的遺傳關(guān)系 分子方差分析（AMOVA）表明，只有24％的遺傳變異是由國家之間的差異來解釋的（表1 5）。 國家間遺傳分化的成對比較表明烏干達(dá)的種質(zhì)為與巴西，秘魯和加納的基因型差異顯著（P <0.001） 6）。 Jaccard的相似系數(shù)范圍從0.0到0.95，平均值為0.56。 超過70％的成對相似系數(shù)在0.50和0.63之間。 DARwin軟件產(chǎn)生的樹狀圖顯示了三個(gè)簇（圖1）。 2）。 為了有效地可視化結(jié)果，從完整樹中修剪樹狀圖以僅顯示引導(dǎo)值大于60的基因型之間的聚類。該修剪樹顯示與完整樹類似的廣泛聚類模式（數(shù)據(jù)未顯示）。 在A組中發(fā)現(xiàn)了來自美國的東非種質(zhì)和品種，巴西和秘魯?shù)拇蠖鄶?shù)品種在B簇中，而大部分加納品種在C簇中發(fā)現(xiàn)。 貝葉斯模型的結(jié)構(gòu)（Pritchard et al。 2000）將個(gè)體分配給兩個(gè)主要的遺傳聚類，因?yàn)樵贙 = 2處觀察到最高的Delta K。所有個(gè)體似乎在其基因組中具有兩個(gè)聚類的組分; 然而，烏干達(dá)和肯尼亞品種的基因組來源于K1群，巴西，加納和秘魯?shù)谋壤浅８叩膩碓从诖豄2的基因組，而坦桑尼亞栽培品種由兩個(gè)簇的混合物組成（圖1）。 結(jié)論 總的來說，紅薯具有高水平的遺傳多樣性。 然而，來自烏干達(dá)各農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)和其他全球區(qū)域的人群中獨(dú)特的等位基因以及區(qū)域多樣性模式的存在表明了更深入地收集和表征種質(zhì)的價(jià)值。 微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)的使用對于更好地選擇需要保存的東西以增加非洲地區(qū)的遺傳多樣性和代表品種特別有用。 這些基因型需要納入國家基因庫的收集品中，并設(shè)法確保其長期保存。 最后，東非紅薯種質(zhì)的起源似乎并非嚴(yán)格來自巴西的單一來源，而是來自多個(gè)來源的連續(xù)引入。 致謝我們非常感謝Norman E. Borlaug農(nóng)業(yè)領(lǐng)導(dǎo)力提升計(jì)劃（LEAP）資助此項(xiàng)研究。 我們衷心感謝坦桑尼亞Mikocheni農(nóng)業(yè)研究??所的Joseph Nduguru博士和Luambano Nessie博士向我們提供來自坦桑尼亞的樣品。 我們還感謝烏干達(dá)國家作物資源研究所的生物科學(xué)設(shè)施的Francis Osingada和Jimmy Akono，生物科學(xué)東部和中部非洲（BACA）的Bramwel Wanjala中心以及國際家畜研究所CIP-Office的Maggie Mwathi。肯尼亞內(nèi)羅畢提供的技術(shù)援助來進(jìn)行研究。