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第40講 生物技術(shù)在其他方面的應用,,第十一單元 生物技術(shù)實踐,[考綱考頻] 1．DNA的粗提取與鑒定(3年3考) 2.PCR技術(shù)的基本操作和應用(3年4考) 3.蛋白質(zhì)的提取和分離(3年2考) 4．從生物組織中提取某些特定的成分(3年5考),,第十一單元 生物技術(shù)實踐,一、DNA的粗提取與鑒定 1．原理：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)等在_______________性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。 2．實驗設(shè)計 (1)材料的選?。哼x用____________相對較高的生物組織。,物理和化學,DNA含量,蒸餾水,濾液,NaCl,蛋白質(zhì),蛋白質(zhì),(4)DNA的析出：將處理后的溶液過濾，加入與濾液體積相等的、_______________溶液可使DNA析出。 (5)DNA的鑒定：將析出的DNA溶于物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑,沸水浴加熱，溶液變藍。 二、多聚酶鏈式反應擴增DNA片段 1．PCR原理 在80～100 ℃的溫度范圍內(nèi)，DNA發(fā)生_________，雙螺旋結(jié)構(gòu)解體，在溫度緩慢降低后，DNA發(fā)生__________，DNA單鏈與________通過堿基互補配對結(jié)合，耐高溫的DNA聚合酶從_______________開始延伸DNA鏈。,冷卻的酒精,變性,復性,引物,引物的3′端,2．PCR的條件 緩沖溶液、DNA模板、2種____________、4種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶，同時要控制溫度。 三、血紅蛋白的提取和分離實驗 1．常用的分離方法：____________法、凝膠電泳法等。 2．基本原理 (1)凝膠色譜法的原理：相對分子質(zhì)量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程_______，流動________；相對分子質(zhì)量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程_______，流動_______________。,引物,凝膠色譜,短,快,長,慢,(2)凝膠電泳法的原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、_______、形狀和________不同，在電場中受到的作用力大小、_______、阻力不同，導致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動_________和運動_________不同。 3．血紅蛋白的提取和分離程序 (1)樣品處理 紅細胞的洗滌→___________的釋放→分離血紅蛋白溶液。 (2)粗分離——_______________：除去樣品中相對分子質(zhì)量較_______的雜質(zhì)。 (3)純化:一般采用_________法對血紅蛋白進行分離和純化。 (4)純度鑒定：一般用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳法來測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，即對血紅蛋白進行純度鑒定。,電量,大小,方向,血紅蛋白,速率,透析,方向,小,凝膠色譜,四、植物有效成分的提取 1．植物芳香油的提取 (1)植物芳香油的主要化學成分：萜類化 合物及其衍生物，具有很強的_______性。提取方法有蒸餾、______和萃取等。,揮發(fā),壓榨,水蒸氣蒸餾法,NaCl,無水Na2SO4,過濾,壓榨,壓榨,過濾,水,萃取,紙層析法,石油醚,1．(2014·高考江蘇卷)下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定” 實驗敘述，錯誤的是( ) A．酵母和菜花均可作為提取DNA的材料 B．DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸餾水 C．向雞血細胞液中加蒸餾水攪拌，可見玻棒上有白色絮狀物 D．DNA溶液加入二苯胺試劑沸水浴加熱，冷卻后變藍,C,解析：酵母菌和菜花細胞的細胞核都含有DNA，可作為提 取DNA的材料；DNA能溶解在不同濃度的NaCl溶液中，且溶解度隨著NaCl濃度的變化而改變，在利用滲透作用原理向生物材料中加入蒸餾水時，一方面促使細胞吸水漲破，另一 方面釋放出的DNA也就溶解在蒸餾水中；向雞血細胞液中加蒸餾水攪拌，目的是加快 細胞吸水 漲 破，釋放其 中的DNA，而DNA則溶解在蒸餾水中，因此玻棒上不可能有白色絮狀物；DNA溶液與二苯胺試劑經(jīng)沸水浴加熱會變藍。,2．標準的PCR過程一般分為變性、復性、延伸三大步，這三大步需要的溫度依次是( ) A．94 ℃、55 ℃、72 ℃ B．72 ℃、55 ℃、94 ℃ C．55 ℃、94 ℃、72 ℃ D．80 ℃、55 ℃、72 ℃ 解析：當溫度上升到90 ℃以上(90～96 ℃)時，雙鏈DNA解旋為單鏈，稱之為變性；當溫度下降到50 ℃(40～60 ℃)左右 時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合；當溫度上升到72 ℃(70～75 ℃)時，溶液中的四種脫氧核苷酸在 Taq DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈，稱為延伸。,A,3．下列有關(guān)“血紅蛋白提取和分離”的敘述中,正確的是( ) A．用蒸餾水進行紅細胞的洗滌，其目的是漲破紅細胞 B．將血紅蛋白溶液進行 透析，其目的是去除相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì) C．血紅蛋白釋放時加入有機溶 劑，其目的是使血紅蛋白溶于有機溶劑 D．整個過程不斷用磷酸緩沖液 處理，是為了維持血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和活性 解析：A項應用生理鹽水洗滌，目的是去除雜 蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化。B項中的血紅蛋白為大分 子，透析的目的是為了除去小分子物質(zhì)。C項中血紅蛋白釋放時 加入有機溶劑，其目的是溶解磷脂，加速血紅蛋白的釋放。,D,4．在玫瑰精油的提取和胡蘿卜素的提取過程中共有的操作是( ) A．紙層析 B．水浴加熱 C．過濾 D．加入NaCl 解析：紙層析法用于胡蘿卜素的鑒定；水浴 加熱用于胡蘿卜素的萃?。辉诿倒寰偷奶崛『秃}卜素的提 取過程中都要用到過濾；在玫瑰精油的提取中加入NaCl使油水分層。,C,考點一 DNA和蛋白質(zhì)的提取,考點二 PCR技術(shù)的基本操作和應用,考點三 植物有效成分的提取,1．DNA的粗提取 (1)DNA與蛋白質(zhì)在不同NaCl溶液中溶解度不同,考點一 DNA和蛋白質(zhì)的提取,析出,溶解,增大,(2)DNA的析出與鑒定 ①析出：將處理后的溶液過濾，加入與濾液等體積的冷卻的_______________溶液(體積分數(shù)為95%)，靜置2～3 min，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物(此即粗提取的DNA)，用玻璃棒沿_______________卷起絲狀物。,酒精,一個方向攪拌,②鑒定,二苯胺試劑,變藍,不變藍,2.蛋白質(zhì)的提取和分離(以血紅蛋白為例) (1)常用的蛋白質(zhì)分離方法 ①凝膠色譜法：,擴散運動,②電泳法原理： a．在一定pH下，一些生物大分子(如多肽、核酸等)可解離的基團會帶上正電或負電，在電場的作用下，這些 帶電分子會向著與其所帶_______________的電極移動。 b．由于分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及_________________________________，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速率，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,電荷相反,分子本身的大小、形狀不同,紅細胞的洗滌,釋放血紅蛋白,凝膠色譜法進行分離和純化,相對分子質(zhì)量,深度思考 1．粗提取DNA時不能用哺乳動物成熟紅細胞作實驗材料的原因是什么？ ___________________________ 2．DNA粗提取實驗中兩次使用蒸餾水，其目的分別是什么？ ___________________________ 3．在血紅蛋白的提取過程中，哪些過程能影響血紅蛋白提取純度？ ___________________________ 4．如何檢測血紅蛋白的分離是否成功？ ___________________________,提示：1.哺乳動物成熟紅細胞無細胞核。 2．第一次的目的是使成熟的雞血細胞漲破放出DNA，第二次的目的是稀釋NaCl溶液，使DNA從溶液中析出。 3．紅細胞的洗滌次數(shù)少，不能除去血漿蛋白；離心速度過高和時間過長，會使白細胞一同沉淀，得不到純凈的紅細胞。 4．看血紅蛋白的紅色區(qū)帶是否均勻、平整地隨著洗滌液緩慢流出。,1．(2015·南京市質(zhì)檢)某生物興趣小組開展DNA粗提取的相關(guān)探究活動，具體步驟如下： 材料處理：稱取新鮮的花菜、辣椒和蒜黃各2份，每份10 g。剪碎后分成兩組，一組置于20 ℃、另一組置于－20 ℃條件下保存24 h。 DNA粗提取： 第一步：將上述材料分別放入研缽中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用兩層紗布過濾，取濾液備用。 第二步：先向6只小燒杯中分別注入10 mL濾液，再加入20 mL體積分數(shù)為95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒緩緩地向一個方向攪拌，使絮狀物纏繞在玻璃棒上。,第三步：取6支試管，分別加入等量的2 mol/L NaCl溶液溶解上述絮狀物。 DNA檢測：在上述試管中各加入4 mL二苯胺試劑，混合均勻后，置于沸水中加熱5 min，待試管冷卻后比較溶液的顏色深淺，結(jié)果如表。 (注：“＋”越多表示藍色越深),分析上述實驗過程，回答下列問題： (1)該探究性實驗課題名稱是_______________________________________________。 (2)第二步中“緩緩地”攪拌，這是為了減少_______________________________________________。,探究不同材料和不同保存溫度對DNA提取量的影響,DNA斷裂,(3)根據(jù)實驗結(jié)果，得出結(jié)論并分析。 ①結(jié)論1：與20 ℃相比，相同實驗材料在－20 ℃條件下保存，DNA的提取量較多。 結(jié)論2：____________________________________________________ _________________________________________________。 ②針對結(jié)論1，請?zhí)岢龊侠淼慕忉專篲_________________________________________________。,等質(zhì)量的不同實驗材料，在相同的保存溫度下，從蒜黃中提取的DNA量最多,低溫抑制了相關(guān)酶的活性，DNA降解速度慢,(4)氯仿密度大于水，能使蛋白質(zhì)變性沉淀，與水和DNA均不相溶，且對DNA影響極小。為了進一步提高DNA 純度， 依據(jù)氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基礎(chǔ)上繼續(xù)操作的步驟是：____________________________________________________ _____________________________________， 然后用體積分數(shù)為95%的冷酒精溶液使DNA析出。,將第三步獲得的溶液與等量的氯仿充分混合，靜置一段時間，吸取上清液,解析：(1)該實驗中把不同的材料在不同條件(溫度)下處理， 目的是探究不同材料和不同保存溫度對DNA提取量的影響。 (2)“緩緩地”攪拌是為了減少DNA斷裂。(3)分析表格可得 出結(jié)論：①相同材料在－20 ℃條件下保存，DNA的提取量 較多。原因可能是低溫抑制了DNA酶的活性，DNA降解速 度慢。②等質(zhì)量的不同實驗材料，在相同保存溫度下，從蒜 黃中提取的DNA最多。(4)依據(jù)氯仿的特性，可在第三步得 到的溶液中加入氯仿，使蛋白質(zhì)變性。,1．PCR相關(guān)技術(shù)原理與條件 (1)PCR：多聚酶鏈式反應的簡稱，是一種體外迅速擴增_______________的技術(shù)。 (2)引物：是一小段RNA或單鏈DNA，它能與_______________的一段堿基序列互補配對。 (3)擴增方向：DNA的合成方向總是從子鏈的_______________延伸。,考點二 PCR技術(shù)的基本操作和應用,DNA片段,DNA母鏈,5′端向3′端,DNA的熱變性,不會失活,兩種引物,2．PCR的反應過程,雙鏈DNA解旋為單鏈,堿基互補配對,5′端向3′端,3.結(jié)果：上述三步反應完成 后，一個 DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復次數(shù)的增多，DNA分子就以_______的形式增加。PCR的反應過程都是在PCR擴增儀中完成的。 4．細胞內(nèi)DNA復制與PCR技術(shù)比較,2n,解旋,TaqDNA聚合酶,高溫,模板,四種脫氧核苷酸,深度思考 下圖為利用PCR技術(shù)擴增目的基因的過程，圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。,(1)從理論上推測，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為多少？ ___________________________ (2)在第幾輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段？ ___________________________ 提示：(1)15/16。(2)第三輪。,2．(2015·河北冀州中學高三仿真)在遺傳病及刑偵破案中常需要對樣品DNA進行分析，PCR技術(shù)能快速擴增DNA片段，在幾個小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝，有效地解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題。據(jù)圖回答相關(guān)問題：,(1)在相應的橫線上寫出引物Ⅱ，并在復性這一步驟中將引物Ⅱ置于合適的位置。 (2)在相應的橫線上寫出循環(huán)一次后生成的DNA分子。 (3)若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32P標記，請分析循環(huán)一次后生成的DNA分子的特點：____________________________，循環(huán)n次后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為_________。,每個DNA分子各有一條鏈含32P,答案：(1)5′—G—A—OH HO—A—G—5′ 5′—G—G……T—C—3′ (2)3′—C—C……A—G—5′ 5′—G—G……T—C—3′ 5′—G—G……T—C—3′ 3′—C—C……A—G—5′,1/2n,(4)PCR反應過程的前提條件是____________，PCR技術(shù)利用DNA的____________原理解決了這個問題。 (5)在對樣品DNA進行分析的過程中發(fā)現(xiàn)，DNA摻雜著一些組蛋白，要去除這些組蛋白可加入的物質(zhì)是__________。,DNA解旋,熱變性,蛋白酶,解析：(1)DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端 延伸DNA鏈，所以引物就提供了3′端，子鏈延伸方向為5′→3′，引物Ⅰ與b鏈部分堿基互補，引物Ⅱ則與a鏈部分 堿基互補，且連接到a鏈的3′端，故引物Ⅱ 的 結(jié) 構(gòu)為5′—G—A—OH。(2)經(jīng)過一次循環(huán)后，產(chǎn)生的 兩個DNA分子分別含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。(3)由于作為原料的四種脫 氧核苷 酸被32P標記，所以新合成的子鏈均含有 放射性，一次循環(huán)后的 兩個DNA各有一條鏈含 32P，若復 制n次，共產(chǎn)生子鏈2n×2條；其中只有2條 DNA母 鏈不含32P，則其所 占比例為2/(2n×2)＝1/2n。,(4)DNA復制是以兩條母鏈為模板，按照堿基互補配對原則進行的。因此，首先要解旋，使兩條母鏈堿基暴露出來，才能按照堿基互補配對的原則把相應的核苷酸一個個地連接起 來。DNA分子在80 ～100 ℃的溫度范圍內(nèi)變性，雙鏈解開成單鏈，當溫度慢慢降低時，又能重新結(jié)合形成雙鏈。(5)本題考查了DNA中雜質(zhì)蛋白質(zhì)的去除，利用酶的專一性，應加入蛋白酶。,考點三 植物有效成分的提取,水蒸氣,油水混合物,水蒸氣蒸餾,除水,[高考警示] (1)加入NaCl的目的是增大鹽水的濃度，有利于玫瑰精油與水的分層； (2)加入無水Na2SO4的目的是吸收精油中殘留的水分。 2．橘皮精油的提取 (1)實驗原理： 橘皮精油的有效成分是檸檬烯，其在用水蒸氣蒸餾時會發(fā)生部分水解，同時使用水中蒸餾法又會產(chǎn)生原料焦糊的問題，故一般采用_______________。 (2)實驗流程： 石灰水浸泡→漂洗→_________→過濾→靜置 →_______________→橘皮油,壓榨法,壓榨,再次過濾,3．胡蘿卜素的提取 (1)實驗原理： 根據(jù)胡蘿卜素易溶于有機溶劑的特點，可用_______________的方法提取，即將提取物溶解在有機溶劑中，將有機溶劑蒸發(fā)后得到提取物。 (2)實驗流程： 胡蘿卜→粉碎→干燥→_______________→過濾→_______________→胡蘿卜素,有機溶劑萃取,萃取,濃縮,深度思考 1.蒸餾時收集的蒸餾液是否是純的玫瑰精油？ ___________________________ 2．怎樣保存密封不嚴的瓶裝玫瑰精油？ ___________________________ 3．萃取過程為何避免明火加熱，采取水浴加熱？ ___________________________ 4．如圖是某同學設(shè)計的紙層析法鑒定胡蘿 卜素粗品的實驗裝置圖，該裝置一個明顯 的錯誤是什么？ ___________________________,提示：1.不是。玫瑰精油將和水蒸氣一同蒸餾出來，故不是純的玫瑰精油。 2．玫瑰精油易揮發(fā)，應保存在溫度較低的地方。 3．這是因為有機溶劑都是易燃物，直接用明火加熱容易引起燃燒、爆炸。 4．沒有蓋玻璃蓋，將導致溶劑大量揮發(fā)。,3．(2015·河北衡水中學月考)請分析回答橘皮精油提取過程的有關(guān)問題： (1)提取橘皮精油，常采用________法而不用蒸餾法，原因是水中蒸餾會導致__________________________________。 (2)為了提高出油率，首先將橘皮___________，并用石灰水浸泡，石灰水的作用是_______________________________________________。 (3)壓榨過程中為了使橘皮油易于與水分離，常加入相當于橘皮質(zhì)量一定百分比的____________________，并調(diào)節(jié)pH至____________。,壓榨,原料焦糊或有效成分水解等問題,干燥去水,破壞細胞結(jié)構(gòu)，分解果膠，防止橘皮壓榨時滑脫,NaHCO3和Na2SO4,7～8,(4)將壓榨液過濾除去固體物和殘渣后，用________法進一步除去質(zhì)量較小的殘留固體物，并分離出上層的橘皮油。將分離出的橘皮油在5～10 ℃下靜置5～7天，使____________，用吸管吸出上層澄清橘皮油，其余部分再次過濾。,離心,雜質(zhì)沉淀,解析：(1)植物芳香油的提取方法有蒸餾、壓榨和萃取等。由 于水中蒸餾會導致原料焦糊或有效成分水解等問題，所以提 取橘皮精油，常采用壓榨法而不用蒸餾法。(2)為了提高出油 率，首先將橘皮干燥去水，并用石灰水浸泡，石灰水浸泡的 目的是破壞細胞結(jié)構(gòu)，分解果膠，防止橘皮壓榨時滑脫。(3) 壓榨過程還要分別加入相當于橘皮質(zhì)量一定百分比的 NaHCO3和Na2SO4，并調(diào)節(jié)pH至7～8,目的是使橘皮油易于 與水分離。(4)將壓榨液過濾除去固體物和殘渣后，用離心法 進一步除去質(zhì)量較小的殘留固體物，并分離出上層的橘皮 油。將分離出的橘皮油在5～10 ℃下靜置5～7天，使雜質(zhì)沉 淀，用吸管吸出上層澄清橘皮油，其余部分再次過濾。,易錯點1 DNA粗提取與血紅蛋白提取易于混淆,[點撥],易錯點2 紙層析操作時的易錯點 [點撥] (1)層析時注意選擇干凈的濾紙，為了防止操作時對濾紙的污染，應盡量避免用手直接接觸濾紙，可以戴手套進行操作。 (2)點樣時應注意點樣斑點不能太大(直徑應小于0.5 cm)，如果用吹風機吹干，溫度不宜過高，否則斑點會變黃。 (3)將點好樣的濾紙卷成筒狀，卷紙時注意濾紙兩邊不能相互接觸，以免因毛細管現(xiàn)象導致溶劑沿濾紙兩邊的移動加快，溶劑前沿不齊，影響結(jié)果。 (4)層析液不可沒及樣品原點，以免色素溶解于層析液中，使鑒定失敗。 (5)層析是否提取到胡蘿卜素，通過與標準樣品中的β-胡蘿卜素作對比予以確認。,1．(2015·哈工大附中月考)將絲狀物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑即呈藍色。( ) 2．(2013·江蘇卷T4A)進行DNA粗提取和鑒定實驗時，加入洗滌劑后用力進行快速、充分的研磨。( ) 3．(2015·石家莊市聯(lián)考)洗滌紅細胞時，使用生理鹽水可防止紅細胞破裂。( ) 4．在PCR技術(shù)中延伸的溫度必須大于復性溫度，而小于變性溫度。( ),×,×,√,√,5．血紅蛋白的顏色可用于凝膠色譜法分離過程的監(jiān)測。 ( ) 6．(2012·江蘇卷T18A)洗滌劑能瓦解細胞膜并增加DNA在 NaCl溶液中的溶解度。 ( ) 7．(2013·北京卷T5D)PCR呈指數(shù)擴增DNA片段是因為上一輪反應的產(chǎn)物可作為下一輪反應的模板。( ) 8．蒸餾法的實驗原理是利用水將芳香油溶解下來，再把水蒸發(fā)掉，剩余的就是芳香油。 ( ),√,×,√,×,