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不同類型疫苗的作用機(jī)制,,2,,,3,1 弱毒疫苗,基本概念： 弱毒疫苗，是一種病原致病力減弱但仍具有活力的完整病原疫苗，也就是用人工致弱或自然篩選的弱毒株，經(jīng)培養(yǎng)后制備的疫苗。 作用機(jī)制： 通過特殊途徑致弱后，其致病力減弱且免疫原性保持不變，經(jīng)過首免、二免甚至三免后，畜禽不產(chǎn)生明顯損傷，卻能被刺激產(chǎn)生明顯的免疫保護(hù)力畜禽不再被感染。,4,,突出的特點(diǎn)表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面 ： （1）誘導(dǎo)包括體液免疫、細(xì)胞免疫的免疫方式，具有較強(qiáng)保護(hù)作用。 （2）由于是活病毒，病毒可以在體內(nèi)增殖，長時(shí)間和機(jī)體細(xì)胞發(fā)生作用，誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫力。 （3）需接種多次，即可以達(dá)到滿意的效果。 （4）可以通過自然感染途徑接種（點(diǎn)眼、滴鼻、口服等），這樣不僅可以產(chǎn)生全身免疫反應(yīng)，而且可以誘導(dǎo)產(chǎn)生局部免疫反應(yīng)。 （5）可以通過病毒所有抗原（病毒包括多種抗原，其中一種或兩種就能引起反應(yīng)）刺激機(jī)體產(chǎn)生反應(yīng)。 （6）一般采用真空凍干工藝，需冷凍保存（-15℃～-20℃）。,5,,其主要缺點(diǎn)： (1)既然是活病毒制劑，有可能污染其它活的病原體； (2)一些減毒活疫苗仍保留有一定的毒力； (3)傳統(tǒng)的減毒活疫苗可能出現(xiàn)病毒毒力回復(fù)； (4)在一些免疫缺陷的個(gè)體中可能誘發(fā)嚴(yán)重疾??； (5)在某些時(shí)候，野毒株感染可以導(dǎo)致活疫苗效果降低； (6)缺損顆?？梢愿蓴_疫苗的免疫效果； (7)對(duì)保存和運(yùn)輸?shù)囊筝^高。,6,2 滅活疫苗,基本概念： 滅活疫苗是先對(duì)病毒或細(xì)菌培養(yǎng)，然后用加熱或化學(xué)劑（通常是福爾馬林）將其滅活。滅活疫苗即可由整個(gè)病毒或細(xì)菌組成，也可由它們的裂解片段組成為裂解疫苗。,7,,作用機(jī)制： 滅活疫苗常需多次接種，接種1劑不產(chǎn)生具有保護(hù)作用的免疫，僅僅是“初始化”免疫系統(tǒng)。必須接種第2劑或第3劑后才能產(chǎn)生保護(hù)性免疫。它引起的免疫反應(yīng)通常是體液免疫，很少甚至不引起細(xì)胞免疫。接種滅活疫苗產(chǎn)生的抗體滴度隨著時(shí)間而下降，因此，一些滅活疫苗需定期加強(qiáng)接種。滅活疫苗通常不受循環(huán)抗體影響，即使血液中有抗體存在也可以接種（如在嬰兒期或使用含有抗體的血液制品后）；它在體內(nèi)不能復(fù)制，可以用于免疫缺陷者。 　滅活疫苗使受種者產(chǎn)生以體液免疫為主的免疫反應(yīng)，它產(chǎn)生的抗體有中和、清除病原微生物及其產(chǎn)生的毒素作用，對(duì)細(xì)胞外感染的病原微生物有較好的保護(hù)效果。滅活疫苗對(duì)病毒、細(xì)胞內(nèi)寄生的細(xì)菌和寄生蟲的保護(hù)效果較差或無效。,8,,其主要優(yōu)點(diǎn)： (1)由于不存在有感染性病毒存在，比較安全； (2)保存方便，無須凍干保存； (3)其它活病原體污染問題較少； (4)生產(chǎn)相對(duì)簡單。,9,,主要缺點(diǎn)： (1)免疫效果一般低于減毒活疫苗，雖然能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生包括中和抗體在內(nèi)的免疫反應(yīng)，但不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。 (2)誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間較短，需要多次接種。 (3)滅活劑對(duì)病毒抗原有影響，而且對(duì)不同的抗原成分影響不同。 (4)由于誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)水平較低，以及各個(gè)抗原成分之間的疫苗應(yīng)答不平衡，可能誘發(fā)疾病。 (5)一般要求對(duì)疫苗進(jìn)行濃縮純化。 (6)一般不能通過自然途徑接種，不易產(chǎn)生局部免疫反應(yīng)。 (7)需要使用佐劑，制劑中存在滅活劑。,10,3 類毒素,基本概念： 細(xì)菌的外毒素經(jīng)甲醛處理后，失去毒性而仍保留其免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的制劑。常用的甲醛溶液的濃度是0.3～0.4%。它可使細(xì)菌外毒素的電荷發(fā)生改變，封閉其自由氨基，產(chǎn)生甲烯化合物（CH2=N-）。其他基團(tuán)（如吲哚異吡唑環(huán)）與側(cè)鏈的關(guān)系亦可改變，成為類毒素。常用的類毒素有白喉類毒素，破傷風(fēng)類毒素。另外，若在類毒素中加入適量的磷酸鋁或氫氧化鋁，即成吸附精制類毒素。,11,,作用機(jī)制： 該類制劑在體內(nèi)吸收較慢，能較長時(shí)間刺激機(jī)體，使機(jī)體產(chǎn)生高滴度抗體，增強(qiáng)免疫效果。類毒素也可與死疫苗混合制成聯(lián)合疫苗。如百白破三聯(lián)疫苗，就是由百日咳死菌苗、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素混合制成的。主要用于兒童，注射后可同時(shí)預(yù)防兒童易發(fā)的白喉、百日咳、破傷風(fēng)三種疾病。類毒素在預(yù)防由外毒素引起的傳染病中起重要作用，可用于人和動(dòng)物的免疫接種，使其通過人工自動(dòng)免疫獲得抗病能力；還可用來免疫動(dòng)物，再從動(dòng)物血液中提取含抗毒素的血清，將此抗血清注入人體后，可使人體通過被動(dòng)免疫的方式，立即獲得相應(yīng)的特異性免疫力。,12,,其優(yōu)點(diǎn)：與滅活菌疫苗相同，不具持續(xù)力，所以必須經(jīng)常追加接種。 其缺點(diǎn)：制備簡單，成本低廉。,13,4 亞單位疫苗,基本概念： 亞單位疫苗是將致病菌主要的保護(hù)性免疫原存在的組分制成的疫苗.在大分子抗原攜帶的多種特異性的抗原決定簇中，只有少量抗原部位對(duì)保護(hù)性免疫應(yīng)答起重要作用。通過化學(xué)分解或有控制性的蛋白質(zhì)水解方法使天然蛋白質(zhì)分離，提取細(xì)菌、病毒的特殊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，篩選出具有免疫活性的片段制成的疫苗，稱為亞單位疫苗。,14,,作用機(jī)制： 亞單位疫苗僅有幾種主要表面蛋白質(zhì)，因而能消除許多無關(guān)抗原誘發(fā)的抗體，從而減少疫苗的副反應(yīng)和疫苗引起的相關(guān)疾病。A群腦膜炎球菌多糖疫苗、傷寒Vi多糖疫苗是比較早的亞單位疫苗，該類疫苗減少了全菌疫苗使用中所出現(xiàn)的不良反應(yīng)；此外，流感裂解疫苗的免疫效果及安全性已在國內(nèi)外的廣泛應(yīng)用中得到了肯定。亞單位疫苗的不足之處是免疫原性較低，需與佐劑合用才能產(chǎn)生好的免疫效果，所以，若全菌（病毒）疫苗不存在嚴(yán)重不良反應(yīng)，仍應(yīng)以全菌（病毒）疫苗為首選。 其優(yōu)點(diǎn)：易制備，價(jià)格低廉。 其缺點(diǎn)：需追加免疫，制備疫苗有局限性。,15,生物技術(shù)疫苗,,16,1結(jié)合疫苗,基本概念： 結(jié)合（以蛋白為載體的細(xì)菌多糖類）疫苗是指采用化學(xué)方法將多糖共價(jià)結(jié)合在蛋白載體上所制備成的多糖-蛋白結(jié)合疫苗，用于提高細(xì)菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、腦膜炎球菌結(jié)合疫苗和肺炎球菌結(jié)合疫苗等。,17,,作用機(jī)制： 病原菌中的抗原性多糖通常是由一相同結(jié)構(gòu)單位重復(fù)組成的線性聚合體，這一結(jié)構(gòu)單位稱之重復(fù)單位（repeat unit,RU),一個(gè)RU常有2-8個(gè)單糖，其中的O-乙?；?、丙酮酰基、糖苷鍵和磷酸酯（Hib莢膜多糖中有此結(jié)構(gòu)）等成分是多糖抗原的主要決定簇。具有這種重復(fù)決定簇結(jié)構(gòu)的多糖抗原能專一性地被B細(xì)胞表面抗原識(shí)別受體而與之牢固結(jié)合，并引起足夠數(shù)量的受體發(fā)生交聯(lián)，產(chǎn)生成帽現(xiàn)象，從而可單獨(dú)觸發(fā)B細(xì)胞分化。因此單一多糖抗原在刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答時(shí)，不需要T輔助性細(xì)胞（TH 細(xì)胞）的輔助就能直接激活B細(xì)胞，是一種T細(xì)胞不依賴性抗原（Ti-Ag）。與Ti-Ag發(fā)生應(yīng)答的是B1細(xì)胞，其細(xì)胞膜表面的抗原識(shí)別受體（即膜表面免疫球蛋白SmIg)為IgM單位，故應(yīng)答中僅產(chǎn)生IgM抗體，無記憶B細(xì)胞(Bm)形成，不產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答，因而免疫原性弱。,18,,將多糖分子經(jīng)化學(xué)共價(jià)結(jié)合到蛋白質(zhì)上，由于蛋白質(zhì)是一個(gè)大分子載體，其分子表面存在多種不同的決定簇，能專一性地被TH細(xì)胞表面抗原識(shí)別受體識(shí)別，從而激活TH細(xì)胞，使之參與免疫應(yīng)答，因此多糖-蛋白結(jié)合物注射機(jī)體后誘發(fā)T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答，應(yīng)答過程中存在著TH-B2細(xì)胞間的協(xié)同作用，其中TH細(xì)胞專一地識(shí)別多糖（抗原）決定簇，是產(chǎn)生抗體的效應(yīng)細(xì)胞。由于B2細(xì)胞（成熟的B淋細(xì)胞）表面的抗原識(shí)別受體為IgG和IgM,故應(yīng)答中產(chǎn)生這兩種抗體，且能形成記憶細(xì)胞，出現(xiàn)加強(qiáng)應(yīng)答，使結(jié)合物中多糖的免疫原性大大提高。同單一多糖疫苗相比，多糖蛋白結(jié)合疫苗具有許多免疫優(yōu)勢(shì)，即它屬于Td-Ag,有TH細(xì)胞參與，刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體主要為IgG，另有少量的IgM，能產(chǎn)生細(xì)胞免疫和加強(qiáng)應(yīng)答，免疫原性強(qiáng)，免疫接種范圍廣。,19,,其優(yōu)點(diǎn)：由于結(jié)合疫苗中兩種抗原經(jīng)化學(xué)共價(jià)結(jié)合后其各自的免疫原性均得以增強(qiáng),如此不僅起到了聯(lián)合接種的目的,還同時(shí)提高了免疫接種效果,帶來一定 的 社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。 其缺點(diǎn)：作為一個(gè)在單一多糖疫苗基礎(chǔ)上進(jìn)一步化學(xué)結(jié)合的疫苗, 其制備成本較高,在某些特殊情況下其發(fā)展受到一定限制；在具體化學(xué)合成中還存在許多問題,其中如多糖和載體蛋白質(zhì)在結(jié)合中均存在自身交聯(lián)而變形,產(chǎn)生一種新抗原( 副反應(yīng)物)的可能。,20,2 合成肽疫苗,基本概念： 合成肽疫苗是一種僅含免疫決定簇組分的小肽, 即用人工方法按天然蛋白質(zhì)的氨基酸順序合成保護(hù)性短肽, 與載體連接后加佐劑所制成的疫苗,是最為理想的安全新型疫苗,也是目前研制預(yù)防和控制感染性疾病和惡性腫瘤的新型疫苗的主要方向之一。,21,,作用機(jī)制： 合成肽疫苗能否產(chǎn)生對(duì)B細(xì)胞表位的特異性免疫應(yīng)答以及應(yīng)答水平的高低主要取決于設(shè)計(jì)的幾種抗原表位的組成和組合方式。一般而言,作為理想的免疫原,抗原分子中要同時(shí)包含目的抗原B細(xì)胞表位和自身或外源T細(xì)胞表位,可誘導(dǎo)出高度特異性的體液或細(xì)胞免疫反應(yīng),從體液免疫和細(xì)胞免疫水平起到預(yù)防或治療作用,使機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)性。另外,通過設(shè)計(jì)隱藏于抗原分子內(nèi)部的表位可增強(qiáng)抗原的免疫原性, 因?yàn)榉?D R 輔助T細(xì)胞表位( pan - DR helper T cell ep itopes , PADRE )或通用T表位( universal T ep itope)以高親和力與機(jī)體內(nèi)常見的HLADR分子結(jié)合,較少受MHC限制。,22,,其優(yōu)缺點(diǎn)：合成肽疫苗能克服常規(guī)疫苗的缺點(diǎn)，很早就被認(rèn)為是動(dòng)物傳染病預(yù)防用的終極疫苗。然而多年的研究結(jié)果表明，合成肽疫苗免疫動(dòng)物后所起的免疫保護(hù)作用并沒有象人們當(dāng)初設(shè)想的那樣理想，同時(shí)證明了構(gòu)建的合成肽疫苗的抗原性及其免疫原性要受到其自身組成及宿主免疫系統(tǒng)等多種因素的影響。在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫的過程中，單一的中和抗原表位是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，增加中和抗原表位的數(shù)目和引入細(xì)胞抗原表位將起到必不可少的輔助協(xié)同作用。,23,3 基因工程疫苗,使用DNA重組生物技術(shù)，把天然的或人工合成的遺傳物質(zhì)定向插入細(xì)菌、酵母菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，使之充分表達(dá)，經(jīng)純化后而制得的疫苗。應(yīng)用基因工程技術(shù)能制出不含感染性物質(zhì)的亞單位疫苗、穩(wěn)定的減毒疫苗及能預(yù)防多種疾病的多價(jià)疫苗。包括基因亞單位疫苗、基因工程活載體疫苗、DNA疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗、基因缺失疫苗。,24,3.1 基因工程亞單位疫苗,基本概念： 基因工程亞單位疫苗（Subunit vaccine）又稱生物合成亞單位疫苗或重組亞單位疫苗，是指將保護(hù)性抗原基因在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)，并以基因產(chǎn)物—蛋白質(zhì)或多肽制成疫苗。,25,,作用機(jī)制： 例如FMDV基因工程亞單位疫苗主要是利用各種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP1蛋白，制成疫苗。Kupper等（1981）等克隆了FMDVVP1基因，將其插入到原核表達(dá)載體PL啟動(dòng)子的下游，實(shí)現(xiàn)VP1基因的原核表達(dá)，并通過間接ELISA和放射免疫試驗(yàn)證實(shí)了其表達(dá)產(chǎn)物具有抗原性，從而為FMDV基因工程亞單位疫苗的研制提供了理論依據(jù)。同年Kield用大腸桿菌表達(dá)的A型FMDVVP1蛋白免疫豬和牛，都可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，用高濃的VP1蛋白或重復(fù)接種牛，可使牛抵抗FMDV強(qiáng)毒的攻擊。,26,,Morgan證實(shí)：用A12-32二聚體多次接種豬，豬也可產(chǎn)生高水平的中和抗體，可以保護(hù)豬免受強(qiáng)毒的攻擊，但是該技術(shù)不適合O型FMDV。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FMDV結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因2A、3C串聯(lián)起來表達(dá)，可以產(chǎn)生76S的類病毒粒子，提純?cè)摬《玖Ｗ?，用來免疫?dòng)物，其免疫效果類似于全病毒，可產(chǎn)生高水平的中和抗體，能抵抗強(qiáng)毒的攻擊，并徹底解決了FMDV常規(guī)疫苗散毒的危險(xiǎn)。除此以外，酵母和桿狀病毒系統(tǒng)也用來表達(dá)VP1蛋白，解決VP1蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中不被修飾加工等問題，以期提高其免疫原性。,27,,其優(yōu)點(diǎn)：①安全性高；②純度高，穩(wěn)定性好；③產(chǎn)量高；④用于病原體難于培養(yǎng)或有潛在致癌性，或有免疫病理作用的疫苗研究。 其缺點(diǎn)：與傳統(tǒng)亞單位疫苗相比，免疫效果較差。 增強(qiáng)其免疫原性的方法： ①調(diào)整基因組合使之表達(dá)成顆粒性結(jié)構(gòu)。 ②是在體外加以聚團(tuán)化，包入脂質(zhì)體或膠囊微球。 ③加入有免疫增強(qiáng)作用的化合物作為佐劑（adjuvant）。,28,,用于亞單位疫苗生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸埃希氏菌、枯草桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳類細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。比較成功的基因工程亞單位疫苗是乙型肝炎表面抗原疫苗。,29,3.2 基因工程活載體疫苗,基本概念： 活載體疫苗(Live recombinant vaccine)可以是非致病性微生物通過基因工程的方法使之表達(dá)某種特定病原物的抗原決定簇基因,產(chǎn)生免疫原性,也可以是致病性微生物通過基因工程的方法修飾或去掉毒性基因,但仍保持免疫原性。在這種疫苗中,抗原決定簇的構(gòu)象與致病性病原體抗原的構(gòu)象相同或者非常相似,活載體疫苗克服了常規(guī)疫苗的缺點(diǎn),兼有死疫苗和活疫苗的優(yōu)點(diǎn),在免疫效力上很有優(yōu)勢(shì),主要有基因突變疫苗和復(fù)制性活載體疫苗。 已報(bào)道的活病毒載體研究包括痘病毒、腺病毒、皰疹病毒、腺聯(lián)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、甲病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和門戈病毒、登革熱病毒、流感病毒、水皰性口炎病毒。,30,作用機(jī)制：,痘病毒載體疫苗： NYVAC株痘病毒是來自哥本哈根疫苗株的高毒致弱毒，不能夠在多數(shù)人類細(xì)胞系中增值，在動(dòng)物體內(nèi)也表現(xiàn)出高度致弱的特征。ALVAC株是來自金絲雀的疫苗株痘病毒，廣泛用作都病毒載體，只限于在禽類中復(fù)制，而不能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)和細(xì)胞中增殖。這倆株非復(fù)制型痘病毒載體都能用于表達(dá)外源基因，刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的免疫反應(yīng)。,31,,腺病毒載體疫苗： 重組腺病毒載體的構(gòu)建相對(duì)容易，重組腺病毒可以達(dá)到很高的滴度，可以通過肌肉、鼻腔或口服進(jìn)行免疫，可以感染很多類型的分裂或靜止期細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞的效率很高。通過基因工程的方法可以構(gòu)建3種類型的重組腺病毒：一種是可以復(fù)制的重組腺病毒；二是不需要輔助病毒的復(fù)制缺陷型的重組腺病毒，需要有特定的包裝細(xì)胞系；三是需要輔助病毒的復(fù)制缺陷型的重組腺病毒。缺失E1/E3區(qū)的復(fù)制缺陷型的重組腺病毒可以插入約7.5kb的外源基因片段；外源基因插入E3和E4缺失區(qū)可以產(chǎn)生可復(fù)制的重組腺病毒,插入的外源基因可達(dá)5-6kb。,32,,在增殖E1缺失的重組體的時(shí)候存在一個(gè)問題，是容易通過重組產(chǎn)生一定比例的可復(fù)制的腺病毒，現(xiàn)在已經(jīng)研制出一種包裝細(xì)胞可以解決這一問題。盡管可復(fù)制腺病毒疫苗應(yīng)用已經(jīng)有許多年了，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Ad4弱毒在人群中水平傳播的例子。不需要輔助病毒的復(fù)制缺陷型重組腺病毒在應(yīng)用中可能更安全，但復(fù)制缺陷型的重組腺病毒的免疫效果卻沒有可復(fù)制的重組腺病毒好，表達(dá)偽狂犬病毒gD糖蛋白的復(fù)制缺陷型重組腺病毒的保護(hù)劑量至少是可復(fù)制型重組腺病毒的250倍。,33,,活載體疫苗的優(yōu)點(diǎn)：可以將外源抗原基因有效地導(dǎo)入機(jī)體，而不需要?jiǎng)佑迷蓟疃?，因而相?duì)安全；而且，不同的抗原可以使用一種載體傳遞系統(tǒng)，一次性免疫就可以達(dá)到保護(hù)機(jī)體抵抗幾種疾病[2]。 活載體疫苗的缺點(diǎn)：宿主會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)大的針對(duì)病毒載體的免疫反應(yīng)，如果機(jī)體已經(jīng)存在對(duì)病毒載體的免疫力，那么初次免疫會(huì)受到影響，再次免疫會(huì)激起機(jī)體強(qiáng)大的排斥反應(yīng)。,34,3.3 DNA疫苗,基本概念： 基因疫苗（gene vaccine),也稱DNA疫苗、核酸疫苗，即將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒上，然后將質(zhì)粒直接導(dǎo)入人或動(dòng)物體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。,35,DNA疫苗的作用機(jī)理,,DNA疫苗能像病毒的活疫苗一樣，進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄為信使RNA，再在細(xì)胞漿中翻譯成蛋白質(zhì)。其中一部分蛋白質(zhì)在降解后與MHC的Ⅰ類分子結(jié)合；而另一部分蛋白質(zhì)也可以分泌出去，再像外源蛋白質(zhì)一樣被APC攝取后，在吞噬溶酶體中降解成的多肽和MHC的Ⅱ類分子結(jié)合(圖7.3)。所以DNA疫苗既能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，又能刺激產(chǎn)生體液免疫。,36,DNA疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的原理 (1)肌細(xì)胞的直接參與,攝取了DNA的肌細(xì)胞可直接對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原進(jìn)行加工、處理和呈遞。DNA疫苗在肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)抗原，然后被細(xì)胞內(nèi)的水解酶降解成8-12個(gè)氨基酸的短肽，它們和MHC的Ⅰ類分子結(jié)合，并呈遞到細(xì)胞表面被CD8 T細(xì)胞的受體識(shí)別而誘發(fā)免疫反應(yīng)。,37,DNA疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的原理 (2)以樹突狀細(xì)胞為主的抗原呈遞細(xì)胞,以樹突狀細(xì)胞為主的抗原呈遞細(xì)胞，即采源于骨髓的APC也可被DNA轉(zhuǎn)染。DNA疫苗在APC中表達(dá)抗原，蛋白質(zhì)被水解酶降解成多肽后與MHC的Ⅰ類分子結(jié)合，再呈遞給CD8 T細(xì)胞而導(dǎo)致體內(nèi)CTL的免疫應(yīng)答。 另外，肌細(xì)胞在攝取DNA以后，DNA疫苗的基因在質(zhì)粒所攜帶的強(qiáng)啟動(dòng)子的作用下，在肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)抗原。此時(shí)的肌細(xì)胞不能自己加工處理抗原，而是將蛋白質(zhì)抗原釋放出去，然后被來源于骨髓的APC捕捉和攝取。,38,DNA疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的原理 (3)肌細(xì)胞和APC共同參與,都能攝取DNA ，并能對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原進(jìn)行加工和處理，降解后的多肽與MHC的Ⅰ類分子結(jié)合，并呈遞給CD8 T細(xì)胞而產(chǎn)生CTL的免疫應(yīng)答。,39,3.5 轉(zhuǎn)基因植物疫苗,基本概念： 轉(zhuǎn)基因植物疫苗是指用植物基因工程技術(shù)與機(jī)體免疫機(jī)理相結(jié)合，生產(chǎn)出的能使機(jī)體獲得特異性抗病能力的疫苗。,40,,作用機(jī)制： 動(dòng)物及人體的呼吸道、消化道及生殖道黏膜與病原體接觸后會(huì)引起機(jī)體的黏膜免疫反應(yīng)，在黏膜的微環(huán)境中產(chǎn)生分泌型IgA抗體和特異的免疫淋巴細(xì)胞，從而構(gòu)成機(jī)體防御病原體感染的第一道屏障?？诜呙缇褪且晕改c道黏膜為接種免疫部位，從而是機(jī)體在胃腸道黏膜產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答進(jìn)而獲得全身性的免疫保護(hù)。,41,,許多文獻(xiàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)基因口服疫苗不僅誘導(dǎo)了機(jī)體系統(tǒng)免疫反應(yīng)，而且還誘導(dǎo)了黏膜免疫反應(yīng)。誘導(dǎo)黏膜免疫是從M細(xì)胞識(shí)別抗原開始的。黏膜免疫反應(yīng)過程如下： （1）抗原與M細(xì)胞表面尚未明確的部位結(jié)合。 （2）抗原被攝入M細(xì)胞的吞飲泡。 （3）M細(xì)胞將識(shí)別的抗原傳遞給巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞再將抗原展示給Th細(xì)胞。 （4）當(dāng)Th細(xì)胞識(shí)別外源的蛋白質(zhì)片段后，Th細(xì)胞協(xié)助激活B細(xì)胞，活化的B細(xì)胞轉(zhuǎn)移到腸系淋巴結(jié)，并在那成熟分化為IgA漿細(xì)胞。,42,,（5）IgA在漿細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，由J鏈連接成雙聚體分泌出來。當(dāng)IgA通過黏膜或漿膜上皮細(xì)胞向外分泌時(shí)，與上皮細(xì)胞產(chǎn)生的分泌片連接成完整的分泌型IgA（sIgA),釋放到分泌液中，分布在黏膜或漿膜表面發(fā)揮作用。當(dāng)疾病因子出現(xiàn)時(shí)，記憶Th細(xì)胞一方面刺激胞毒T細(xì)胞攻擊受感染的細(xì)胞；另一方面迅速刺激記憶B細(xì)胞分泌中和抗體，消滅入侵的病原體。 其優(yōu)點(diǎn)：安全性好、生產(chǎn)成本低。 其缺點(diǎn)是：免疫原性差。,43,3.6 基因缺失疫苗,基本概念： 通過缺失與病毒力相關(guān)的基因，減弱其毒力但不喪失其免疫原性而制成的疫苗。 該類疫苗中最有代表性的例子是豬偽狂犬病毒(PRV)糖蛋白E基因 (原稱gT基因)缺失(gE-)及胸腺核苷酸激酶基因突變失活(TK-)株的活疫苗。gE 和TK基因產(chǎn)物的缺失使野毒PRV的致病性顯著減弱, 其免疫力不僅與常規(guī)的弱毒苗相當(dāng),而且由于gE基因的缺失,使其成為一種標(biāo)記性疫苗。即接種該疫苗免疫的豬在產(chǎn)生免疫力的同時(shí)不產(chǎn)生抗gE抗體,而自然感染的帶毒豬具有抗gE抗體。,44,,作用機(jī)制： 第一代基因缺失疫苗 PRV的TK基因是主要的毒力基因,對(duì)其進(jìn)行缺失便成為第一代基因缺失疫苗。TK 基因缺失株經(jīng)生物學(xué)和動(dòng)物試驗(yàn)證明對(duì) Balb/c小白鼠有較高的安全性,接種豬能產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫力并能抵抗PRV強(qiáng)毒的攻擊,而且免疫豬后還可以通過PCR的方法將免疫接種豬與自然感染豬區(qū)分開來。但是,由于 TK基因?qū)儆诿傅鞍谆?在體內(nèi)不能產(chǎn)生其相應(yīng)的抗體, 因此僅缺失TK基因不能用血清學(xué)方法區(qū)別開免疫接種豬與自然感染豬,要將此區(qū)別開來必須缺失相應(yīng) 的糖蛋白基因。此外,僅缺失TK基因的弱毒株對(duì)犢牛還有較低的毒力, 對(duì)狗、 貓毒力更強(qiáng)。,45,,第二代基因缺失疫苗 第二代基因缺失疫苗是在TK缺失疫苗的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,比僅僅TK缺失的疫苗更加優(yōu)越。第一代TK缺失疫苗只能夠采用核酸雜交,限制性內(nèi)切酶圖譜, 空斑放射自顯影同野毒株相區(qū)別, 第二代基因缺失疫苗除 了在TK基因引入了一個(gè)缺失外,在非編碼必需糖蛋白的基因內(nèi)引入了一個(gè)新的缺失,或插入一個(gè)報(bào)告基因,這樣得到的突變株就不能產(chǎn)生被缺失的糖蛋白,從而免疫動(dòng)物就不能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體, 且可以通過血清學(xué)方法將免疫接種豬與自然感染野毒的豬相區(qū)別, 這也是第二代基因缺失疫苗的最顯著特點(diǎn)。此外, 某些糖蛋白的缺失,可以進(jìn)一步降低毒力。,46,,其優(yōu)缺點(diǎn)： 基因缺失疫苗的突出優(yōu)點(diǎn)是疫苗株不易返祖而重新獲得毒力。由于基因缺失疫苗株病毒的復(fù)制能力并不明顯降低, 其所導(dǎo)致的免疫應(yīng)答不低于常規(guī)的弱毒活疫苗。在單基因缺失的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建的雙基因缺失或多基因缺失疫苗會(huì)更為安全可靠。基因缺失疫苗的生產(chǎn)工藝與相應(yīng)的弱毒疫苗相同,在生產(chǎn)過程和生產(chǎn)成本上都不存在投入過高的問題。盡管存在實(shí)際應(yīng)用中的安全性問題, 特別是病毒在自然狀態(tài)下可能與野毒株發(fā)生重組, 或者發(fā)生核酸修補(bǔ),使疫苗株原來缺失的基因恢復(fù)而重新獲得毒力,以及部分基因缺失疫苗對(duì)孕畜和仔畜的毒力偏高問題。,47,4 抗原-抗體復(fù)合物疫苗,基本概念： 抗原-抗體復(fù)合物疫苗是由特異性高免血清按照恰當(dāng)?shù)谋壤c抗原混合而制成。,48,,作用機(jī)制： 使用抗原—抗體復(fù)合物疫苗可增強(qiáng)雞和哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)，加強(qiáng)保護(hù)性免疫，其作用機(jī)制和方式尚不明了。以下是倆種常見的解釋。 （1）與濾泡樹狀細(xì)胞結(jié)合 ： 許多抗原以抗原遞呈細(xì)胞（APCs)如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面的Fc受體為中介，而被捕獲、加工和遞呈。病毒與抗體形成復(fù)合物以后，由于抗體分子的Fc片段與APC的Fc受體有很高的親和性，因而使得與抗體的病毒更易更有效地與APC結(jié)合，一旦抗原-抗體復(fù)合物被APC吞噬和內(nèi)化，即可激活B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，刺激B淋巴細(xì)胞成為抗體分泌細(xì)胞，從而引起強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。并且，樹突狀細(xì)胞（DC）位于次生淋巴器官，可轉(zhuǎn)運(yùn)抗原-抗體復(fù)合物至淋巴結(jié)。,49,,Boursne等研究表明。接種IBDV-Ab疫苗后,導(dǎo)致脾臟產(chǎn)生更多的生發(fā)中心。他們推測(cè), 復(fù)合物疫苗的作用機(jī)理可能與脾臟、法氏囊的濾泡樹突狀細(xì)胞的結(jié)合有關(guān)。另外,Wen曾報(bào)道小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(M5) 、脾臟及骨髓樹突狀細(xì)胞(DC)體外攝取IC的量明顯多于單純抗原,同時(shí)等研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體抗原遞呈細(xì)胞(APC)對(duì)IC的攝取量主要通過以下兩種途徑: 抗 H BsIgG可通過Fc段與APC膜上的Fc受體交聯(lián)結(jié)合而大量攝入IC; 通過抗HBs對(duì)HBsA g的聚集作用,形成較大顆粒,易被APC內(nèi)化攝入刪除。,50,,（2）通過Fc受體與APC結(jié)合,增強(qiáng)APC的遞呈能力,促進(jìn)APC分泌細(xì)胞因子： Fc受體廣泛分布于APC等免疫效應(yīng)細(xì)胞表面, 抗體通過與 Fc 受體結(jié)合,能夠介導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)抗原的攝取等作用,參與對(duì)抗原誘生的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)作用。APC細(xì)胞被激活而攝入大量顆粒性抗原異物,不僅可增強(qiáng)依賴抗體的細(xì)胞殺傷活性(antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)作用,而且還可使激活的M5等APC通過分泌白細(xì)胞介素 1(interleukin-1,IL-1)、白細(xì)胞介素12(interleukin-12,IL-12)等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答,并增強(qiáng)對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的剌激作用。,51,,另據(jù)報(bào)道，HBsAg與ant-iHBs結(jié)合成免疫復(fù)合物后,可增強(qiáng)鼠巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞攝取抗原,并且通過對(duì)脾T細(xì)胞的抗原遞呈試驗(yàn)顯示,可使脾T細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)及釋放細(xì)胞因子。比單純抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的作用更強(qiáng)大,且免疫復(fù)合物本身還可起佐劑作用,增加抗原的免疫原性, Zheng 等研究通過HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠證明,經(jīng)HBsAg-抗HBs抗復(fù)合物免疫后,能夠誘生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)和Th1型細(xì)胞因子。,52,,（3）抗原-抗體復(fù)合物具有交叉遞呈能力： 近年來國外相關(guān)研究表明, APC通過一系列復(fù)雜機(jī)制使外源性的免疫復(fù)合物抗原,在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的加工處理后,與MHC iv類分子結(jié)合后被遞呈APC表面,激活 CD8+T淋巴細(xì)胞,進(jìn)而激活( cytoto xict lymphocyte,CTL)[ 10 - 11]。 此外, M ontfoort NV等[12]進(jìn)一步認(rèn)為,血液中的補(bǔ)體成分C1q可直接加強(qiáng)免疫復(fù)合物的交叉?zhèn)鬟f。,53,5 腫瘤細(xì)胞疫苗,基本概念： 它是在機(jī)體腫瘤組織中提取腫瘤細(xì)胞，經(jīng)滅活處理后使瘤細(xì)胞喪失致瘤性，但仍保持其免疫原性和抗原性，將其主動(dòng)免疫機(jī)體，在理論上能提供腫瘤細(xì)胞的所有抗原，包括特異性抗原和廣譜性抗原，以期形成抗腫瘤免疫應(yīng)答。,54,,作用機(jī)制： 特異性抗原表達(dá)低下，免疫原性低，常無法誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此，通常采用在疫苗中加入誘導(dǎo)免疫的細(xì)胞因子，或?qū)爰?xì)胞因子的編碼基因，或?qū)雲(yún)f(xié)同共刺激分子的編碼基因，借此來達(dá)到增強(qiáng)疫苗免疫原性的目的。還有白細(xì)胞介素２、白細(xì)胞介素４和粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）參與。,55,6 病毒顆粒樣疫苗,基本概念： 病毒樣顆粒（VLP）是含有某種病毒一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒形態(tài)結(jié)構(gòu)上類似完整病毒具有與完整病毒相似的免疫原性并通過激活抗原提呈細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，從而制得病毒顆粒樣疫苗。,56,,作用機(jī)制： VLP在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似，作為顆粒性抗原可激活樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞，將其提呈給T，B淋巴細(xì)胞，從而有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。 在免疫小鼠的脾細(xì)胞中，VLP以HA－特異性MHCI或MHCII－限制性多肽結(jié)合物方式刺激HA特異性CD4＋和CD8＋細(xì)胞分泌Th1型( IFN-γ）和Th2型IL-4 IL-5 細(xì)胞因子。免疫過VLP的小鼠可觀察到明顯的MHCⅠ或MHCⅡ型抗原肽刺激產(chǎn)生的IFN-γ和IL-2，而rHA疫苗免疫則不會(huì)出現(xiàn)CD4＋T細(xì)胞比CD8＋T細(xì)胞分泌更多的IL-4和IL-5。提示VLP可同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1和Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)。 Zhang等 研究表明HA VLP免疫C57BL／6小鼠,可激活B2細(xì)胞活性,并產(chǎn)生以IgG2a為主的抗體,57,,其優(yōu)點(diǎn)：由于ALP不含核酸不能自主復(fù)制不具有傳染性，并且能夠誘導(dǎo)交叉免疫中關(guān)鍵的細(xì)胞免疫應(yīng)答，可能具有更廣泛的抗感染譜更適合老年人等高危人群。 其缺點(diǎn)：安全、穩(wěn)定還有待研究。,,謝謝,