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一、基因工程的基本操作程序,目的基因的獲取 的構(gòu)建 將 導(dǎo)入受體細(xì)胞 目的基因的 .,,,,基的因表達(dá)載體,目的基因,檢測與鑒定,二、目的基因的獲取 1．目的基因 主要是編碼蛋白質(zhì)的 ，也可以是一些具 有 的因子。 2．目的基因的獲取方法 (1)從基因文庫中獲取目的基因。 ①基因文庫 a．含義：將含有某種生物不同基因的許多 ，導(dǎo)入 的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不 同的基因，稱為基因文庫。,,,結(jié)構(gòu)基因,調(diào)控作用,DNA片段,受體菌,(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。 ①PCR含義：是一項在生物體外 的核酸合成技術(shù)，全稱是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 ②PCR原理： 。 ③擴(kuò)增過程 變性：目的基因DNA受熱變性后解為單鏈 ↓ 復(fù)性： 與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合 ↓ 延伸：在 作用下延伸子鏈 (3)人工合成法：適于合成基因 ，且 已知的目的基因。,,,復(fù)制特定DNA片段,DNA雙鏈復(fù)制,引物,DNA聚合酶,較小,核苷酸序列,三、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心 1．基因表達(dá)載體的功能 (1)使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以 給下一代。 (2)使目的基因能夠 和發(fā)揮作用。 2．基因表達(dá)載體的組成,,,遺傳,表達(dá),四、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 1．轉(zhuǎn)化 目的基因進(jìn)入 內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi) 和 。 的過程。 2．導(dǎo)入過程 (1)導(dǎo)入植物細(xì)胞,,,受體細(xì)胞,維持穩(wěn)定,表達(dá),(3)導(dǎo)入微生物細(xì)胞 ①方法：用 處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(這種細(xì)胞稱為 )。 ②受體細(xì)胞：原核細(xì)胞(使用最廣泛的是大腸桿菌細(xì)胞)。 ③原核生物的特點： 。,,,Ca2＋,感受態(tài)細(xì)胞,繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少等,五、目的基因的檢測與鑒定 1．分子水平的檢測(連線) 2．個體水平的鑒定 (1) 的接種實驗。 (2)對基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行 。,,,抗蟲或抗病,活性比較,一、目的基因的獲取 閱讀教材P8～10，觀察分析圖1－6,1－8，探討下列問題： 1．獲取目的基因的方法有哪些？ 提示：有從基因文庫中獲取，PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成三種方法。 2．聯(lián)系DNA復(fù)制，比較PCR技術(shù)與DNA復(fù)制的不同點(填寫下表)。,提示：解旋酶 高溫 細(xì)胞內(nèi) 細(xì)胞核 細(xì)胞外 PCR擴(kuò)增儀 解旋酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 溫和 二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 閱讀教材P11，觀察分析圖1－10，探討下列問題： 1．基因工程的核心是哪一步操作？其目的是什么？ 提示：基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心，其目的是使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 2．如圖是基因表達(dá)載體模式圖，請回答下列問題：,(1)分別寫出①②③④⑤各代表什么。 提示：①啟動子，②終止子，③標(biāo)記基因(抗生素抗性基因)，④復(fù)制原點，⑤目的基因(插入基因)。 (2)圖中①②③各有什么作用？ 提示：①啟動子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，負(fù)責(zé)驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。②終止子：起終止轉(zhuǎn)錄的作用。③標(biāo)記基因(抗生素抗性基因)：作用是檢測受體細(xì)胞中是否有目的基因，并將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。 (3)啟動子和終止子與起始密碼子和終止密碼子是一回事嗎？ 提示：不是一回事，啟動子和終止子位于DNA上，是基因表達(dá)必需的部分。而起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結(jié)束。,3．嘗試?yán)昧鞒虉D表示如何構(gòu)建基因表達(dá)載體。 提示：,,,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 閱讀教材P11～13內(nèi)容，探究下列問題： 1．將目的基因?qū)氩煌N類生物所選用的方法是否相同？常選用的受體細(xì)胞是什么？ 提示：不相同。常選用的受體細(xì)胞及導(dǎo)入方法如下表：,,,2.根據(jù)圖示簡述目的基因在受體細(xì)胞中的位置不同會引起遺傳上的差別嗎？ 提示：圖中②會使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)，原因是在進(jìn)行細(xì)胞減數(shù)分裂時，細(xì)胞核上的DNA經(jīng)復(fù)制后平均分配到兩個子細(xì)胞中，保證了親子代遺傳性狀的穩(wěn)定性，而①細(xì)胞減數(shù)分裂時，細(xì)胞質(zhì)是不均分的，子細(xì)胞不一定含有目的基因。,,,四、目的基因的檢測與鑒定 閱讀教材P13～15有關(guān)內(nèi)容，仔細(xì)觀察分析圖1－14、1－15， 自主完成以下問題： 1．如何檢測目的基因在真核生物中穩(wěn)定遺傳？ 提示：采用DNA分子雜交技術(shù)。 2．什么是基因探針？如何檢測目的基因是否開始發(fā)揮功能？ 提示：基因探針是用放射性同位素標(biāo)記的目的基因的DNA片段。 從轉(zhuǎn)基因生物中提取mRNA，用標(biāo)記的目的基因作探針，與mRNA雜交，如果顯示出雜交帶，則表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA，意味著目的基因開始發(fā)揮功能。,,,3．檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)的方法是什么？其原理是什么？ 提示：抗原—抗體雜交法。原理是抗原能與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合。 4．舉例說明進(jìn)行個體生物學(xué)水平的鑒定方法有哪些？ 提示：如做抗蟲或抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較，以確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的功能活性是否與天然產(chǎn)品相同等。,(浙江高考)天然的玫瑰沒有藍(lán)色花，這是由于缺少控 制藍(lán)色色素合成的基因B，而開藍(lán)色花的矮牽牛中存在序列已知的基因B，現(xiàn)用基因工程技術(shù)培育藍(lán)玫瑰，下列操作正確的是( ) A．提取矮牽牛藍(lán)色花的mRNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)的DNA，再 擴(kuò)增基因B B．利用限制性核酸內(nèi)切酶從開藍(lán)色花矮牽牛的基因文庫中獲 取基因B C．利用DNA聚合酶將基因B與質(zhì)粒連接后導(dǎo)入玫瑰細(xì)胞 D．將基因B直接導(dǎo)入大腸桿菌，然后感染并轉(zhuǎn)入玫瑰細(xì)胞,,,【研析】本題通過特定的實例主要考查基因工程的相關(guān)概念及操作要領(lǐng)。具體解題過程如下：,,,[審]——提取信息,信息a：由A項“提取矮牽牛藍(lán)色花的mRNA”可知獲取目的基因的方法為逆轉(zhuǎn)錄。 信息b：由B項的“基因文庫”可知目的基因可直接提取，無需再切割獲取。 信息c：由C項的“基因B與質(zhì)粒連接”可知連接工具為DNA連接酶。 信息d：由D項的“基因B直接導(dǎo)入”可知這種方法是錯誤的，因未構(gòu)建基因表達(dá)載體。,[析]——解讀信息,解讀a：利用逆轉(zhuǎn)錄法可獲取目的基因，欲增加其數(shù)量可采取PCR擴(kuò)增技術(shù)。 解讀c、d：DNA聚合酶的作用是連接單個的脫氧核苷酸，而DNA連接酶的作用是連接相對應(yīng)的DNA片段；構(gòu)建基因表達(dá)載體是基因工程技術(shù)的核心步驟，否則將造成基因工程操作失敗。,[答案] A,解答基因工程基本操作程序題目的一般步驟 ——三辨、三找、一析、一理 (1)三辨：分辨限制酶的種類及識別序列和切割位點。在切割目的基因和載體時，一般用同一種限制酶切割，也可用不同的限制酶切割，但兩種限制酶切割后產(chǎn)生的黏性末端中堿基要互補(bǔ)配對。 (2)三找：找出標(biāo)記基因、目的基因及其插入位點。一般來說，質(zhì)粒中至少有一個標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因。明確目的基因的插入位點是在標(biāo)記基因內(nèi)部還是在標(biāo)記基因之外。,,,(3)一析：分析目的基因插入質(zhì)粒后是否破壞了標(biāo)記基因。如果質(zhì)粒中有一個標(biāo)記基因，插入后一般不破壞標(biāo)記基因；如果質(zhì)粒中有兩個標(biāo)記基因，則需看標(biāo)記基因中是否有插入位點，如果某一標(biāo)記基因中有插入位點，則目的基因插入質(zhì)粒后該標(biāo)記基因被破壞。 (4)一理：理清判斷目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法。一般用含有某種抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)受體菌，如果有兩種抗生素抗性基因，還需判斷用哪一種抗生素來檢測。,農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了廣泛的運用。下面是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的示意圖，試回答下列問題：,,,(1)一般情況下農(nóng)桿菌不能感染的植物是________，利用農(nóng)桿菌自然條件下感染植物的特點，能實現(xiàn)______________________。 具體原理是農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中存在T－DNA片段，它具有可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞并整合到受體細(xì)胞的________上的特點，因此只要將攜帶外源基因的DNA片段插入到________(部位)內(nèi)部即可。 (2)根據(jù)T－DNA這一轉(zhuǎn)移特點，猜測該DNA片段上可能含有控制____________________(酶)合成的基因。 (3)圖中c過程中，能促進(jìn)農(nóng)桿菌移向植物細(xì)胞的物質(zhì)是________類化合物。 (4)植物基因工程中將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法除了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法之外，還可采取的方法是______________________。(至少寫出兩種),,,[解析] (1)一般農(nóng)桿菌不能感染的植物是單子葉植物，可感染雙子葉植物和裸子植物，利用其感染性，可實現(xiàn)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞。這里需要特別明確的是真正可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞并整合到受體細(xì)胞的染色體上的是農(nóng)桿菌質(zhì)粒上的T－DNA片段，因此目的基因必須插入到該部位才能導(dǎo)入成功。(2)根據(jù)T－DNA這一轉(zhuǎn)移特點，可以推測出DNA片段上能控制合成DNA連接酶、限制酶才能實現(xiàn)與雙子葉植物細(xì)胞染色體DNA的整合。(3)植物細(xì)胞受傷后可產(chǎn)生酚類化合物，促進(jìn)農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移。(4)植物基因工程中將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法除了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法之外，還有基因槍法和花粉管通道法。 [答案] (1)單子葉植物 將目的基因?qū)氲街参锛?xì)胞 染色體DNA T－DNA片段 (2)DNA連接酶、限制酶 (3)酚 (4)基因槍法、花粉管通道法,[網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建] 填充：①利用PCR擴(kuò)增 ②從基因文庫中獲取 ③基因表達(dá)載體的構(gòu)建 ④農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 ⑤目的基因的檢測與鑒定 ⑥D(zhuǎn)NA分子雜交 ⑦抗原—抗體雜交,———————[課堂歸納]—————————,[關(guān)鍵語句] 1．獲取目的基因的常用方法有：從基因文庫中獲取目的基因和利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。 2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 3．一個基因表達(dá)載體的組成，除了目的基因外，還必須有啟動子、終止子以及標(biāo)記基因等。 4．將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法。 5．培育轉(zhuǎn)基因動物時，受體細(xì)胞一般是受精卵，目的基因的導(dǎo)入方法常用顯微注射技術(shù)。 6．檢測目的基因是否導(dǎo)入和轉(zhuǎn)錄，常用分子雜交技術(shù)；檢測 是否翻譯，常用抗原—抗體雜交技術(shù)。,1．有關(guān)目的基因獲取的理解，不正確的是( ) A．目的基因可以從自然界中分離，也可以人工合成 B．目的基因主要指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 C．基因文庫就是基因組文庫 D．cDNA文庫只含有某種生物的一部分基因 解析：基因文庫又分為基因組文庫和部分基因文庫。cDNA文庫是部分基因文庫。,[答案] C,2．哪些是基因表達(dá)載體的必需組成部分( ) ①啟動子 ②終止密碼子 ③標(biāo)記基因 ④目的基因 ⑤終止子 A．①②③④ B．①③④⑤ C．①②④⑤ D．①②③⑤ 解析：啟動子位于基因表達(dá)載體的首端，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)；終止子相當(dāng)于一盞紅色信號燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來；標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來；目的基因是基因表達(dá)載體上必須具有的結(jié)構(gòu)。,[答案] B,3．(重慶高考)如圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關(guān)敘述，正確的是( ) A．②的構(gòu)建需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA聚合酶參與 B．③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上 C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲性狀 D．⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異,解析：構(gòu)建載體需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，A錯誤；③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒上的T－DNA整合到④的染色體上，B錯誤；染色體上含有目的基因，但目的基因也可能不能轉(zhuǎn)錄或者不能翻譯，或者表達(dá)的蛋白質(zhì)不具有生物活性，C錯誤；植株表現(xiàn)出抗蟲性狀，說明含有目的基因，屬于基因重組，為可遺傳變異，D正確。,[答案] D,4．PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA，需要的條件是( ) ①目的基因 ②引物 ③四種脫氧核苷酸 ④DNA聚合酶等 ⑤mRNA ⑥核糖體 A．①②③④ B．②③④⑤ C．①③④⑤ D．①②③⑥ 解析：PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA與體內(nèi)DNA復(fù)制一樣，需要模板、引物、原料、酶等條件。,[答案] A,5．為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用倍受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。,(1)獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制酶作用于圖中的__________處，DNA連接酶作用于________處。(選填“a”或“b”) (2)將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和________法。 (3)為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的______________作探針進(jìn)行分子雜交檢測，又要用________________方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。,解析：基因工程的工具酶——限制酶和DNA連接酶的作用是斷開或連接兩核苷酸之間的磷酸二酯鍵。將目的基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法。目的基因的檢測與鑒定，常利用DNA分子雜交技術(shù)等作分子水平的檢測，有時還需進(jìn)行個體生物學(xué)水平的鑒定。 答案：(1)a a (2)基因槍(花粉管通道) (3)目的基因 一定濃度鹽水澆灌(移栽到鹽堿地),