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,第一章 人體的內(nèi)環(huán)境與穩(wěn)定,,專題1 基因工程,1．1 DNA重組技術(shù)的基本工具,,專題1 基因工程,學(xué)習(xí)導(dǎo)航,1.了解基因工程的概念、誕生及發(fā)展。 2．掌握限制酶及DNA連接酶的作用。[重、難點(diǎn)] 3．理解載體需具備的條件。[重點(diǎn)],,專題1 基因工程,一、基因工程,DNA重組技術(shù),基因,DNA分子水平,二、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀” 1．來源：主要來自于____________。 2．特點(diǎn)：具有專一性。 (1)識(shí)別雙鏈DNA分子的某種________________。 (2)切割特定核苷酸序列中的特定位點(diǎn)。 3．作用：斷開每一條鏈中____________的兩個(gè)核苷酸之間的____________。 4．結(jié)果：產(chǎn)生____________和____________。,原核生物,特定核苷酸序列,特定部位,磷酸二酯鍵,黏性末端,平末端,巧記 限制酶有特性，“特定”突顯專一性。,三、DNA連接酶——“分子縫合針” 1.,大腸桿菌,互補(bǔ)的,黏性末端,噬菌體,黏性末端,平末端,2．作用：形成________________。 3．結(jié)果：形成重組DNA分子。 四、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車” 1．作用：將____________送入細(xì)胞中。 2．種類：_________、λ噬菌體衍生物和動(dòng)植物病毒等。,磷酸二酯鍵,外源基因,質(zhì)粒,3.,限制酶切割位點(diǎn),標(biāo)記基因,1．判一判 (1)通過基因工程改造成的生物為新物種。( ) (2)限制酶和DNA解旋酶的作用部位相同。( ) (3)DNA連接酶起作用時(shí)不需要模板( ),√,,,2．連一連 將基因工程中的有關(guān)名詞與其對(duì)應(yīng)內(nèi)容連線,1．切割位點(diǎn)：磷酸二酯鍵。 磷酸二酯鍵指的是如圖圓圈中的化學(xué)鍵，而限制酶切割的只能是箭頭①所指的化學(xué)鍵，因?yàn)槿χ辛硪粋€(gè)化學(xué)鍵屬于一個(gè)核苷酸內(nèi)部的化學(xué)鍵。,限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶),作用位點(diǎn)示意圖,2．限制酶切出的黏性末端和平末端的比較 (1)黏性末端：限制性核酸內(nèi)切酶在識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時(shí)形成的。 (2)平末端：限制性核酸內(nèi)切酶在識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)形成的。,3．限制性核酸內(nèi)切酶與DNA解旋酶的比較 (1)相同點(diǎn)：都作用于DNA分子中的化學(xué)鍵。 (2)不同點(diǎn)：兩者作用部位不同，前者作用于磷酸與脫氧核糖之間的磷酸二酯鍵，而后者作用于兩個(gè)堿基之間的氫鍵，即上述作用位點(diǎn)示意圖中的箭頭②所指處的氫鍵。,4．限制酶切割位點(diǎn)與DNA片段的關(guān)系 (1)鏈狀DNA分子上有1個(gè)酶切位點(diǎn)，用限制酶切割后形成2個(gè)DNA片段；如果有2個(gè)酶切位點(diǎn)，用限制酶切割后則形成3個(gè)DNA片段。依次類推。 (2)環(huán)狀DNA分子上有1個(gè)酶切位點(diǎn)，用限制酶切割后形成一條鏈狀DNA；如果有2個(gè)酶切位點(diǎn)，用限制酶切割后形成2個(gè)DNA片段。依次類推。 特別提醒 限制酶作用結(jié)果 不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一個(gè)DNA分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同，如果相同，可重新互補(bǔ)配對(duì)。,(2014山東濟(jì)寧高二檢測)下表為常用的限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)及其識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，由此推斷以下說法正確的是( ) (注：Y＝C或T，R＝A或G) A．限制酶切割后不一定形成黏性末端 B．限制酶的切割位點(diǎn)一定在識(shí)別序列的內(nèi)部 C．不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端 D．一種限制酶一定只能識(shí)別一種核苷酸序列,A,[解析] 由表得知，HindⅡ能識(shí)別4種不同的核苷酸序列，切割后不一定形成黏性末端，D項(xiàng)錯(cuò)誤；Sau3AⅠ的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列的外部，B項(xiàng)錯(cuò)誤；不同限制酶切割后可能形成相同的黏性末端，如BamHⅠ與Sau3AⅠ切割的末端，C項(xiàng)錯(cuò)誤;限制酶切割后不一定形成黏性末端，也可能是平末端，A項(xiàng)正確。,(1)表格中哪兩種限制酶切割出來的DNA片段末端可以互補(bǔ)結(jié)合？其末端互補(bǔ)序列是什么？ (2)從表中各限制酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)的差異，得出限制酶有何特性？ 提示：(1)Bam HⅠ和Sau 3 AⅠ?！狦ATC—。 (2)專一性。,(2)判斷黏性末端或平末端是否由同一種限制酶切割形成的方法是：將黏性末端或平末端之一旋轉(zhuǎn)180后，看它們是否是完全相同的結(jié)構(gòu)。,(2014棗莊高二檢測)現(xiàn)有一長度為1 000個(gè)堿基對(duì)(bp)的DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ酶切后得到的DNA分子仍是1 000 bp，用Kpn Ⅰ單獨(dú)酶切得到400 bp和600 bp兩種長度的DNA分子，用EcoR Ⅰ、Kpn Ⅰ同時(shí)酶切后得到200 bp和600 bp兩種長度的DNA分子，該DNA分子的酶切圖譜正確的是( ),解析：選D。從題干中“用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ酶切后得到的DNA分子仍是1 000 bp”，再結(jié)合選項(xiàng)中DNA分子的可能酶切圖譜分析可知，此DNA分子是環(huán)狀，故A、B排除。同理，從“用Kpn Ⅰ單獨(dú)酶切得到400 bp和600 bp兩種長度的DNA分子”，又可推知圖譜中應(yīng)有兩個(gè)Kpn Ⅰ酶切位點(diǎn)，故選D。,DNA連接酶及相關(guān)的比較,1．限制酶與DNA連接酶的相互作用,2．幾種工具酶作用特點(diǎn)的比較,連接兩個(gè)DNA片段,基因工程,a,限制性核酸內(nèi)切酶,能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開,a,在脫氧核苷酸鏈上添加單個(gè)脫氧核苷酸,DNA的,a,復(fù)制解旋酶,使DNA堿基間的氫鍵斷裂，把兩條螺旋的雙鏈解開,DNA復(fù)制,b,特別提醒 有關(guān)酶的進(jìn)一步說明 (1)DNA連接酶無識(shí)別的特異性，連接兩個(gè)互補(bǔ)末端的DNA片段間的磷酸二酯鍵，而DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸加到已有DNA片段上，且需一條DNA鏈為模板。 (2)解旋酶打開堿基對(duì)之間的氫鍵，但氫鍵是分子間的靜電引力，不需要通過酶的催化形成。,下列有關(guān)DNA連接酶的敘述正確的是( ) A．T4DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間連接起來 B．Ecoli DNA連接酶能將雙鏈DNA片段平末端之間進(jìn)行連接 C．DNA連接酶能恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵 D．DNA連接酶可連接DNA雙鏈的氫鍵，使雙鏈延伸,C,[解析] DNA連接酶能使兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵,從而將它們連接起來。Ecoli DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間連接起來，不能將雙鏈DNA片段平末端之間進(jìn)行連接。T4DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。,(2014江蘇徐州高二質(zhì)檢)如圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是( ) A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②,C,解析：本題考查不同工具酶的作用及作用特點(diǎn)。圖示中①表示該酶切割DNA分子雙鏈產(chǎn)生黏性末端的過程，用到的酶是限制性核酸內(nèi)切酶，②是黏性末端連接的過程，用到的酶是DNA連接酶，③是DNA分子解旋的過程，要用解旋酶，④是DNA復(fù)制時(shí)子鏈的形成過程，需要DNA聚合酶。,基因工程中常用載體——質(zhì)粒,1．來源：質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、酵母菌等生物中。 2．結(jié)構(gòu)：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并且具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子，如圖所示：,3．標(biāo)記基因：質(zhì)粒上有一些特殊的基因，如抗四環(huán)素基因、抗氨芐青霉素基因，用于對(duì)重組DNA進(jìn)行鑒定和選擇。 4．載體的作用 (1)用它作為運(yùn)載工具，將目的基因送入受體細(xì)胞中去。 (2)利用它在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。 5．限制酶的選取原則 限制酶識(shí)別的切割位點(diǎn)，不能在載體的復(fù)制起始點(diǎn)、標(biāo)記基因等載體必需的基因片段，切點(diǎn)所處位置必須在載體需要的基因片段之外，避免載體因目的基因的插入而失活或影響鑒定和篩選。,特別提醒 細(xì)胞膜上的載體與基因工程中的載體的區(qū)別 (1)化學(xué)本質(zhì)不同：細(xì)胞膜上的載體的化學(xué)成分是蛋白質(zhì)；基因工程中的載體可能是物質(zhì)，如質(zhì)粒(DNA)、λ噬菌體的衍生物，也可能是生物，如動(dòng)植物病毒等。 (2)功能不同：細(xì)胞膜上的載體功能是協(xié)助細(xì)胞膜控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞；基因工程中的載體是一種“分子運(yùn)輸車”，把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。,目前基因工程所用的質(zhì)粒載體主要是以天然細(xì)菌質(zhì)粒的各種元件為基礎(chǔ)重新組建的人工質(zhì)粒，pBR322質(zhì)粒是較早構(gòu)建的質(zhì)粒載體，其主要結(jié)構(gòu)如圖所示。,(1)構(gòu)建人工質(zhì)粒時(shí)要有抗性基因，以便于___________________________________________________。 (2)pBR322分子中有單個(gè)EcoR Ⅰ限制酶作用位點(diǎn)，EcoR Ⅰ只能識(shí)別序列—GAATTC—，并只能在G與A之間切割。若在某目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)EcoR Ⅰ的切點(diǎn)，請(qǐng)畫出目的基因兩側(cè)被限制酶EcoR Ⅰ切割后所形成的黏性末端： ___________________________________________________。,篩選(鑒別)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞,(3)pBR322分子中另有單個(gè)的BamH Ⅰ限制酶作用位點(diǎn),現(xiàn)將經(jīng)BamH Ⅰ處理后的質(zhì)粒與另一種限制酶Bgl Ⅱ處理得到的目的基因,通過DNA連接酶作用恢復(fù)__________鍵，成功獲得了重組質(zhì)粒，說明___________________________________________________。,磷酸二酯,兩種限制酶(BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ)切割得到的黏性末端相同,(4)為了檢測上述重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入原本無ampR和tetR的大腸桿菌，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖二的菌落。再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖三的結(jié)果(空圈表示與圖二對(duì)照無菌落的位置)。與圖三空圈相對(duì)應(yīng)的圖二中的菌落表現(xiàn)型是___________________________ _________圖三結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌導(dǎo)入的是________________________________________________。,能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素,pBR322質(zhì)粒,[解析] (1)質(zhì)粒作為基因表達(dá)載體的條件之一是要有抗性基因，以便于篩選(鑒別)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。(2)同一限制酶切割DNA分子產(chǎn)生的黏性末端相同，根據(jù)題意可知:該目的基因兩側(cè)被限制酶EcoR Ⅰ切割后所形成的黏性末端為：,(3)DNA連接酶催化兩個(gè)DNA片段形成磷酸二酯鍵；而通過DNA連接酶作用能將兩個(gè)DNA分子片段連接，表明經(jīng)兩種限制酶(BamH Ⅰ和BglⅡ)切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。(4)由題意知：由于與圖三空圈相對(duì)應(yīng)的大腸桿菌能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，而不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長，故可推知與圖三空圈相對(duì)應(yīng)的圖二中的菌落能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素。由圖二、圖三結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌都能抗氨芐青霉素，而經(jīng)限制酶BamH Ⅰ作用后，標(biāo)記基因tetR 被破壞，而不能抗四環(huán)素，故多數(shù)大腸桿菌導(dǎo)入的是pBR322質(zhì)粒。,圖一中有多個(gè)限制酶作用位點(diǎn)，對(duì)生物本身有何作用？在基因工程中有何好處？ 提示：防止外源DNA入侵細(xì)菌，是一種自我防御；在基因工程中可供目的基因插入其中。,基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒,便于重組和篩選。已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是 —G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是 —↓GATC—。根據(jù)圖示判斷下列操作正確的是( ) A．目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅱ切割 B．目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅰ切割 C．質(zhì)粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割 D．質(zhì)粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割,D,解析：首先把目的基因切下來要用到限制酶Ⅱ；如果再用限制酶Ⅱ切割質(zhì)粒，則2個(gè)標(biāo)記基因都被切開，標(biāo)記基因?qū)⑹プ饔?。若用限制酶Ⅰ切割質(zhì)?？杀Ａ粢粋€(gè)標(biāo)記基因，而產(chǎn)生的黏性末端和限制酶Ⅱ切割下來的目的基因可以互補(bǔ)配對(duì)。,