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單克隆抗體技術,提綱,單克隆抗體的概念 單克隆抗體的制備 單克隆抗體的應用,萊克多巴胺單克隆抗體,1975年英國科學家Milstein和Kohler將產(chǎn)生抗體的淋巴細胞同腫瘤細胞融合，成功建立了單克隆抗體技術，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。 每個B淋巴細胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對某種抗原決定簇的特異性抗體，而腫瘤細胞可以無限增殖，因此雜交瘤細胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)條件下分泌大量單克隆抗體。 單克隆抗體技術的最主要優(yōu)點是可以用不純的抗原分子大量制備純一的單克隆抗體。,一、單克隆抗體的概念（monoclonal antibody, McAb）,概念：通過B細胞雜交瘤技術, 獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細胞克隆產(chǎn)生的具有均一性抗體的技術。 細胞克隆：由一個細胞增殖而成的細胞集團。,B淋巴細胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。將這種B細胞與非分泌型的骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，再進一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細胞既具有瘤的無限生長的能力，又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細胞進行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價、單一的特異性抗體。,雜交瘤技術,通過融合經(jīng)過免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞，以獲得同時具有抗體分泌功能和保持細胞永生性特征的雜交瘤細胞克隆。是獲取單克隆抗體的主要技術途徑。,二、單克隆抗體的制備,（一）制備原理： 用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷酸酶（TK-）的瘤細胞變異株與脾臟的B細胞融合。采用HAT選擇性培養(yǎng)基對融合細胞進行培養(yǎng)和篩選。 HAT選擇性培養(yǎng)基： 培養(yǎng)基中加次黃嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。,單克隆抗體制備原理,HAT培養(yǎng)基的選擇原理： （1）氨基蝶呤(A)是葉酸拮抗劑，可阻斷細胞利用正常途徑合成DNA，細胞在含有氨甲蝶呤的培養(yǎng)基中不能通過正常途徑合成DNA。 （2）瘤細胞是HGPRT酶陰性細胞，自身不能通過替代途徑合成DNA而繁殖。 （3）B細胞雖含有HGPRT，但不能在體外培養(yǎng)存活（只存活5~7d，且功能下降)。 （4）融合細胞含有B細胞和瘤細胞，其中瘤細胞核利用B細胞的HGPRT酶進行旁路合成DNA而存活。,單克隆抗體的制備原理,經(jīng)HAT選擇后的各種細胞的結果,融合的B細胞和瘤細胞; 由于雜交細胞獲得了： （1）HGPRT、 TK 酶基因并正常表達、利用培養(yǎng)基中的H、T 合成DNA （2）瘤細胞的“永生性”而得以存活和無限擴增。 未融合的B細胞、融合的B細胞和B細胞以及B細胞的多聚體; 因不能正常合成DNA而死亡 未融合的瘤細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、以及瘤細胞的多聚體等; 因不能正常合成DNA而死亡。,（二）基本制備流程,（三）單克隆抗體的制備步驟,1、免疫原的制備 2、免疫動物 3、骨髓瘤細胞的準備 4、細胞融合 5、雜交瘤細胞及陽性孔的篩選 6、陽性孔的特異性檢測及特異性陽性孔的克隆 7、單克隆抗體的制取,1、免疫原的制備,顆粒性抗原：病毒、細菌、真菌等微生物和蛋白等分子量大于5000Da生物物質(zhì)。 可溶性抗原：多糖、藥物、激素、肽類等分子量小于 5000 Da 物質(zhì)。 注意：可溶性抗原需與BSA、OA等載體交聯(lián)后成顆粒性抗原才能刺激動物產(chǎn)生可應用的高效價的抗體。,2、免疫動物,（1）動物選擇：一般采用與骨髓瘤細胞供體來源同一品系的動物進行免疫（如：小鼠）。由于免疫動物品系與所采用的骨髓瘤細胞差異較遠，產(chǎn)生的雜交瘤細胞穩(wěn)定性越差。 （2）抗原與載體：抗原分為可溶性和顆粒性抗原，載體分膜體和珠體。 （3）免疫途徑：較為常用 的途徑有腹腔，皮下淋巴器官或靜脈等，較為常用的途徑是腹腔注射。,2、免疫動物,可溶性抗原（蛋白質(zhì)）： 以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化，分多點小鼠皮下注射，總量為0.3ml～0.6ml，間隔３～５周再同樣注射一次，10天后，斷尾取血一滴，測抗體效價，選滴度高的小鼠做融合試驗。一個月后可以經(jīng)靜脈（尾靜脈）給予無佐劑抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，殺死小鼠取脾做融合用。 顆粒性抗原 如抗原來源方便，可以不加佐劑而增加免疫次數(shù)，縮短間隔時間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以１％濃度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。,為什么要多次免疫小鼠？,正常小鼠脾臟含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B淋巴細胞，一只純種小白鼠估計能產(chǎn)生1.0×107~5.0×107種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤融合，只能有千萬分之一的機會獲得某一種特定抗體。所以為了提高得到某種雜交瘤的機會，必須加強免疫，使產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細胞大量增加。,3. 骨髓瘤細胞的準備,細胞株處于良好的生長狀態(tài)，本身不能分泌任何抗體或免疫球蛋白； 瘤細胞的來源應與制備脾細胞小鼠為同一品系，以便兩者組織相容性抗原一致； 細胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)或TK缺陷狀態(tài)。,4. 細胞融合,（1）細胞融合劑和融合手段 病毒融合：高濃度仙臺病毒等 化學融合劑：PEG等 電融合技術：國產(chǎn)新芝牌電融合儀 （2）融合技術 一種是加入融合劑后直接離心使兩種細胞緊密接觸（R<3000r/min），另一種是加入融合劑后輕輕攪動融合。,,（3）提高融合頻率的可能途徑 融合過程中由于細胞特性、操作過程、PEG毒性等多種因素都可能影響融合而減少融合頻率。 方法：對親本細胞預處理，改進融合技術，加入飼養(yǎng)層細胞促進雜交瘤生長。,致敏淋巴細胞,骨髓瘤細胞,,,離心 1000rpm 10min,50%PEG 1ml,,培養(yǎng)液 10ml,,,,離心 1000rpm 7min,37。C搖動、由慢漸快1min、靜止1.5min,,加入HAT培養(yǎng)液懸浮細胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi),5. 雜交瘤細胞及陽性孔的篩選,細胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HAT培養(yǎng)基換液，等到融合細胞覆蓋孔底10%-50%時，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽性孔，共獲50多個對上述抗原有反應的陽性孔。,融合細胞的篩選方法,A）ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定法）用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細胞和病毒等單克隆抗體（McAb）的檢測。 B）放射免疫法 （RIA）用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。 C）FACS(熒光激活細胞分類儀)用于檢查細胞表面抗原的McAb檢測。 D）間接免疫螢光法 （IFA）用于細胞和病毒McAb的檢測。,6. 陽性孔的檢測,6.融合細胞的克隆,經(jīng)過抗體測定的陽性孔，可以擴大培養(yǎng)，進行克隆，以得到單個細胞的后代分泌單克隆抗體。 克隆化的方法很多，包括有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平板法及熒光激活分離法等。,有限稀釋法,,,,,計數(shù),,103/ml,102/ml,10/ml,0.5-2/孔,7. 單克隆抗體的制取,制取方式： 體外——培養(yǎng)罐法 體內(nèi)——腹腔接種 純化： 鹽析、層析、制備型HPLC 鑒定： 特征鑒定——Ig類型、親和力、效價、特異性 決定簇鑒定——是否針對同一決定簇,（1）體外制備,體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg／ ml。如果大量生產(chǎn)，費用較高。 隨著大規(guī)模的生產(chǎn)，需大量血清而使成本增加，同時血清會影響單抗的純度，大量血清的存在干擾抗體活性。1978年iscove用補充大豆類脂，牛血清蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白等添加成分的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞成功。,（2）體內(nèi)制備,體內(nèi)腹腔注射雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水?？煞磸褪占瘮?shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法。 在動物體內(nèi)制備單抗，可在短時間獲得足夠量的單抗夠?qū)嶒炇覒?，但要消耗大量活的小鼠而不適合規(guī)模化生產(chǎn)。同時腹水中可能混有小鼠本身的抗體會給單抗的純化帶來困難。,雜交瘤細胞的凍存,當獲得產(chǎn)生所需的單克隆抗體的雜交瘤細胞后，必須將一部分雜交瘤細胞保存，否則在連續(xù)傳代的過程中，可能產(chǎn)生突變或染色體的漂移以至喪失固有特性或丟失產(chǎn)生抗體的特性。另外在長期的培養(yǎng)過程中，難免不發(fā)生污染以至于毀滅。所以必須冷藏保存一部分。,雜交瘤細胞通常用含有8％--10%的二甲亞砜和20％小牛血清的培養(yǎng)基凍存于液氮中，在液氮中細胞可以保存多年，在-80℃中可以作3-6個月短期保存。凍存細胞需要緩慢降溫，復蘇細胞時需快速升溫，這樣可以確保細胞有較高的存活率。,單克隆抗體的特性,① 單一特異性，與一個抗原決定簇反應； ② 可重復性，能夠提供完全一樣的抗體制劑； ③ 一經(jīng)制出，可無限量地供應； ④ 生產(chǎn)單克隆抗體，不一定需要純的抗原； ⑤ 能查出混合物中存在的用常規(guī)方法查不出的少量成分。,局限性,（1）單克隆抗體固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍。由于單克隆抗體不能進行沉淀和凝集反應，所以很多檢測方法不能用單克隆抗體完成。 （2）單克隆抗體的反應強度不如多克隆抗體。 （3）制備技術復雜，而且費時費工，所以單克隆抗體的價格也較高,三、單克隆抗體的應用,單克隆抗體在醫(yī)學上的應用 1）單克隆抗體的靶向制劑 2）單克隆抗體在腫瘤診斷與治療中的應用 3）單抗藥物 制備方法： 與藥物直接連接 McAb 小分子 藥物 大分子 藥物,,,,（1）藥物與抗體直接偶聯(lián) 通過化學反應使藥物分子的氨基與抗體分子的羧基之間直接形成穩(wěn)定的酰胺鍵。 利用氧化劑把藥物分子上的糖基氧化成羰基 利用羰基與抗體分子的氨基反應形成西弗氏堿，最后還原。 這樣的靶向制劑保留一定的藥物活性，并具有一定的選擇性。 如：1,4-溴柔紅霉素與腫瘤細胞單抗形成的偶合物，對腫瘤有明顯的選擇毒性。,,小分子交聯(lián)劑： 同型雙功能：戊二醛、順烏頭酸酐、馬來酸酐、戊二酐。 異型雙功能：N-琥珀酰胺基-3-丙酸和寡肽等。 大分子聚合物：葡聚糖、多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等,單抗藥物,特異性溶解血栓藥物 抗腫瘤藥物 其它藥物 利妥昔單抗是全球第一個上市的單克隆抗體藥物。,,單抗藥物面臨的問題,單抗藥物還存在一些尚未解決的問題，最突出的問題是如何降低單抗的免疫原性，單抗的異源性所引起的抗體反應，不但降低了單抗的效價，而且會給患者帶來嚴重的后果。 因此，對異源性單抗進行改造以及人源性單抗的研制成為單抗研究的重點。,