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2019-2020年高中生物《動物細(xì)胞工程》教案1 新人教版選修3 一、教學(xué)目標(biāo) 1.簡述動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程、條件及應(yīng)用。 2.簡述通過動物體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆動物的過程和應(yīng)用前景。 3.舉例說出動物細(xì)胞融合與單克隆抗體的原理和應(yīng)用。 二、教學(xué)重點和難點 1.教學(xué)重點 （1）動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程及條件。 （2）用動物體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆動物的過程。 （3）單克隆抗體的制備和應(yīng)用。 2.教學(xué)難點 （1） 用動物體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆動物的過程。 （2） 單克隆抗體的制備過程。 三、教學(xué)策略 有了第一節(jié)的基礎(chǔ)，學(xué)生對本節(jié)內(nèi)容易于理解。因此，本節(jié)教學(xué)采用講授、自學(xué)、討論等相結(jié)合的教學(xué)方法。具體建議如下。 在動物細(xì)胞培養(yǎng)的教學(xué)中，可把這部分內(nèi)容歸納成三個問題：（1）為什么要進(jìn)行動物細(xì)胞的培養(yǎng)？（2）什么是動物細(xì)胞的培養(yǎng)？（3）怎樣進(jìn)行動物細(xì)胞的培養(yǎng)？第三個問題是本節(jié)課的重點。關(guān)于動物細(xì)胞的培養(yǎng)過程，教師可參照教材中的動物細(xì)胞培養(yǎng)過程示意圖進(jìn)行講解，講解中要注意區(qū)分原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)這兩個概念。對于動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件，則要從學(xué)生已有的內(nèi)環(huán)境的知識出發(fā)，啟發(fā)學(xué)生自己動腦思考這個問題，以加深對培養(yǎng)條件的理解。 在動物體細(xì)胞核移植技術(shù)及克隆動物的教學(xué)中，可首先讓學(xué)生列舉所知道的克隆動物，調(diào)動學(xué)生已有的知識。隨后可向?qū)W生提問：克隆動物的方法與植物組織培養(yǎng)一樣嗎？然后向?qū)W生說明目前動物體細(xì)胞克隆是通過核移植技術(shù)來實現(xiàn)的，以引入本節(jié)課的主題。關(guān)于核移植技術(shù)發(fā)展簡史，可讓學(xué)生在課堂上閱讀，本節(jié)課的重點和難點是在動物體細(xì)胞核移植技術(shù)過程，教材中選用了一個非常好的素材──以誕生在我國的高產(chǎn)克隆奶牛為例，來說明體細(xì)胞核移植的過程。教師應(yīng)充分利用和挖掘教材內(nèi)容，帶領(lǐng)學(xué)生一步步弄清動物體細(xì)胞核移植技術(shù)的過程。對于體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景和存在的問題這部分內(nèi)容，可結(jié)合本節(jié)教材“思考與探究”中的有關(guān)問題，以及“拓展視野”中的有關(guān)克隆羊多利的早衰問題等，讓學(xué)生討論。 在細(xì)胞融合和單克隆抗體的教學(xué)中，教師可先啟發(fā)學(xué)生回顧植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的過程，再通過動植物細(xì)胞異同點的對比，引導(dǎo)學(xué)生大膽推測出動物細(xì)胞融合與植物原生質(zhì)體融合的原理及方法基本相同，以培養(yǎng)學(xué)生的知識遷移能力。隨后通過教材上的用滅活病毒誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合過程的示意圖，重點講解為什么滅活的病毒可用來做誘導(dǎo)物，并指出動物細(xì)胞的融合也需要把多個兩種細(xì)胞放在一起，讓它們隨機(jī)融合后，再從中篩選雜交細(xì)胞。最后教師要講明動物細(xì)胞融合技術(shù)的意義和應(yīng)用，以便自然過渡到單克隆抗體上來。 關(guān)于單克隆抗體的教學(xué)，教師要利用好教材提供的材料，突出從問題入手的思路，先介紹醫(yī)療實踐中僅靠細(xì)胞培養(yǎng)難以獲得大量抗體，然后，一步一步啟發(fā)學(xué)生討論怎樣解決這個問題。要把科學(xué)家在研制單克隆抗體過程中，通過大膽的想像，創(chuàng)造性地解決問題的過程作為本節(jié)教學(xué)的重點和亮點，使學(xué)生在獲得單克隆抗體知識的同時，受到創(chuàng)新精神的教育。 四、答案和提示 2.2.1動物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù) （一）思考與探究 1.幼齡與老齡動物的組織細(xì)胞比較，分化程度低的與分化程度高的組織細(xì)胞比較，哪一種更易于培養(yǎng)？思考一下，這是什么道理？ 提示：細(xì)胞的衰老與動物機(jī)體的衰老有著密切的關(guān)系，細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動物細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，有絲分裂旺盛，老齡動物則相反。所以，一般來說幼年動物的組織細(xì)胞比老年動物的組織細(xì)胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細(xì)胞的分化程度越低，則增殖能力越強(qiáng)，所以更容易培養(yǎng)。 2.動物細(xì)胞培養(yǎng)要經(jīng)過脫分化的過程嗎？為什么？ 提示：脫分化又稱去分化，是指分化細(xì)胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂形捶只?xì)胞特性的過程。植物的任何一部分，甚至單個細(xì)胞都具有長成完整植株的能力。但要發(fā)育成完整植株，必須先脫分化，脫分化的細(xì)胞具有發(fā)育成任何組織的能力，然后進(jìn)行再分化，形成完整植株。植物細(xì)胞培養(yǎng)主要用于農(nóng)林生產(chǎn)中的作物、苗木育種，快速繁育種苗、培育無病毒植株等，這就要求植物的組織或細(xì)胞先進(jìn)行脫分化。動物細(xì)胞的培養(yǎng)有各種用途，一般而言，動物細(xì)胞培養(yǎng)不需經(jīng)過脫分化過程。因高度分化的動物細(xì)胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個體的能力，所以，動物細(xì)胞也就沒有類似植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)時的脫分化過程了。要想使培養(yǎng)的動物細(xì)胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動物干細(xì)胞，使其分化成所需要的組織或器官。 3.1997年，美國威斯康星州的一個奶牛場有一頭名叫盧辛達(dá)（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為30.8 t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀(jì)錄。目前世界各國高產(chǎn)奶牛場奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般為十幾噸，而我國奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為3～4 t。 （1）能利用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)嗎？請說明理由。 提示：可以用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)。盧辛達(dá)的產(chǎn)奶量很高，說明它有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達(dá)的體細(xì)胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進(jìn)程。 但同時需注意，該克隆牛不能無限制地推廣，其數(shù)量不宜過多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。 （2）如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)的任務(wù)交給你，你將如何對它進(jìn)行克??？ 提示：首先從盧辛達(dá)耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易?。┥霞羧∫恍K組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細(xì)胞。從屠宰場取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟。用顯微針去除卵母細(xì)胞的核，再將耳細(xì)胞注入卵母細(xì)胞，用電刺激方法使卵母細(xì)胞與體細(xì)胞融合，這時供體核就進(jìn)入了受體卵母細(xì)胞，再用電刺激或化學(xué)物質(zhì)激活注入了體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞，使其完成減數(shù)分裂和發(fā)育過程。核移植胚胎在體外短時間培養(yǎng)后，挑選正常卵裂的胚胎植入經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛體內(nèi)。 4.體細(xì)胞核移植技術(shù)在研究和應(yīng)用上還存在什么問題？請你查閱資料，了解這方面的前沿動態(tài)。 提示：在研究方面，克隆動物基因組重新編程的機(jī)制尚不清楚，克隆技術(shù)效率低，克隆動物畸形率高、死亡率高、易出現(xiàn)早衰等問題。這些問題尚在研究中。 在應(yīng)用上，生產(chǎn)克隆動物費用昂貴，距大規(guī)模應(yīng)用還有一定距離。 （二）正文中討論題 【討論1】 多細(xì)胞動物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境的知識，思考并討論以下問題： 1.體外培養(yǎng)細(xì)胞時需要提供哪些物質(zhì)？ 提示：充足的營養(yǎng)供給、適宜的溫度、適宜的pH和氣體環(huán)境。 2.體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要什么樣的環(huán)境條件？ 提示：無菌、無毒的環(huán)境。 【討論2】 1.在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？ 提示：為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質(zhì)全部來自有重要利用價值的動物提供的體細(xì)胞，在供體細(xì)胞的細(xì)胞核移至受體細(xì)胞之前，必須將受體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐摹? 2.用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞，想一想，這是為什么？ 提示：培養(yǎng)的動物細(xì)胞一般當(dāng)傳代至10～50代左右時，部分細(xì)胞核型可能會發(fā)生變化，其細(xì)胞遺傳物質(zhì)可能會發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細(xì)胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細(xì)胞核移植中，為了保證供體細(xì)胞正常的遺傳基礎(chǔ)，通常采用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞。 3.你認(rèn)為用上述體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動物，是對體細(xì)胞供體動物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？ 提示：克隆動物絕大部分DNA來自于供體細(xì)胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體中的DNA是來自于受體卵母細(xì)胞。所以，用教材中所述的方法克隆的動物不是供核動物完全相同的復(fù)制。 此外，即便動物的遺傳基礎(chǔ)完全相同，但動物的一些行為、習(xí)性的形成與所處環(huán)境有很大關(guān)系，核供體動物生活的環(huán)境與克隆動物所生活的環(huán)境不會完全相同，其形成的行為、習(xí)性也不可能和核供體動物完全相同，從這一角度看，克隆動物不會是核供體動物100%的復(fù)制。 （三）尋根問底 胰蛋白酶真的不會把細(xì)胞消化掉嗎？為什么？ 提示：胰蛋白酶除了可以消化細(xì)胞間的蛋白外，長時間的作用也會消化細(xì)胞膜蛋白，對細(xì)胞有損傷作用，因此必須控制好胰蛋白酶的消化時間。 （四）旁欄思考題 1.進(jìn)行動物細(xì)胞傳代培養(yǎng)時用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是什么成分？用胃蛋白酶行嗎？ 提示：用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。胃蛋白酶作用的適宜pH約為2，當(dāng)pH大于6時，胃蛋白酶就會失去活性。胰蛋白酶作用的適宜環(huán)境pH為7.2～8.4。多數(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜pH為7.2～7.4，胃蛋白酶在此環(huán)境中沒有活性，而胰蛋白酶在此環(huán)境中活性較高，因此胰蛋白酶適宜用于細(xì)胞培養(yǎng)時的消化。 2.為什么對動物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時通常要添加血清？ 提示：血清中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白質(zhì)主要為白蛋白和球蛋白。氨基酸有多種，是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，其中有些氨基酸動物細(xì)胞本身不能合成（稱為必需氨基酸），必須由培養(yǎng)液提供。血清激素有胰島素、生長激素等及多種生長因子（如表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、類胰島素生長因子等）；血清還含有多種未知的促細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)，能促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖和貼附。因此，細(xì)胞培養(yǎng)時，要保證細(xì)胞能夠順利生長和增殖，一般需添加10%～20%的血清。 2.2.2動物細(xì)胞融合與單克隆抗體 思考與探究 1.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)有什么不同？ 提示：植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁，然后再融合；動物細(xì)胞融合是兩個體細(xì)胞直接融合。 2.制備單克隆抗體時，為什么要選用B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞？ 提示：哺乳動物感染抗原后，其體內(nèi)會形成相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動物在免疫反應(yīng)的過程中，每一種B淋巴細(xì)胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細(xì)胞大量增殖。B淋巴細(xì)胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細(xì)胞是一種癌細(xì)胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，它會兼有兩個親本細(xì)胞的特性──在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。 五、知識拓展 1.動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是如何發(fā)展起來的？ 1907年，哈里森（Harrison）在無菌條件下用淋巴液作培養(yǎng)基，培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織存活數(shù)周，并觀察到神經(jīng)細(xì)胞突起的生長過程，由此創(chuàng)建了蓋片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法，奠定了動物組織體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)。之后，又有人將懸滴培養(yǎng)法改良為雙蓋片培養(yǎng)，提高了傳代效率并減少了污染。1923年，卡雷爾（Carrel）設(shè)計了卡氏瓶培養(yǎng)法，擴(kuò)大了組織生存空間。 1951年， 厄爾 （Earle） 發(fā)明了體外培養(yǎng)動物細(xì)胞的人工合成培養(yǎng)基。1951年，波米拉（Pomerat）設(shè)計了灌流小室，使細(xì)胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液中，便于作顯微攝影和細(xì)胞代謝的研究。1957年，格拉夫（Graff）用灌流技術(shù)進(jìn)一步提高了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的效率。1957年，杜爾貝科（Dulbecco）等人采用胰蛋白酶消化處理和應(yīng)用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了單層細(xì)胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)法的出現(xiàn)，對組織培養(yǎng)的發(fā)展起了很大的推動作用。此后單層培養(yǎng)成為組織培養(yǎng)普遍應(yīng)用的技術(shù)。20世紀(jì)60年代后，動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)開始起步，并逐步發(fā)展。20世紀(jì)80年代后，隨著基因工程和其他細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)、生物制藥及其他許多技術(shù)的基礎(chǔ)，在現(xiàn)代生物技術(shù)中發(fā)揮著重要的作用。 2.為什么動物細(xì)胞要分散成單個細(xì)胞培養(yǎng)？用酶消化的是什么物質(zhì)？ 細(xì)胞原代培養(yǎng)時可以分散成單個細(xì)胞培養(yǎng)，也可以用細(xì)胞群（團(tuán)）、組織塊培養(yǎng)，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，最終都為細(xì)胞培養(yǎng)。 分散成單個細(xì)胞、細(xì)胞群（團(tuán)）后容易培養(yǎng)，細(xì)胞所需的營養(yǎng)容易供應(yīng)，其代謝廢物容易排出；而用大塊組織培養(yǎng)時，內(nèi)部細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)和代謝廢物的排出都較困難，因此，這些細(xì)胞在體外長時間的生存和生長就較困難。同時，分散成單個細(xì)胞培養(yǎng)，可使得在細(xì)胞水平操作的其他技術(shù)得以實現(xiàn)。 用酶消化的是細(xì)胞間基質(zhì)，細(xì)胞間基質(zhì)主要成分有膠原蛋白、層粘連蛋白、纖粘連蛋白、彈性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，從而使細(xì)胞相互分離。 3.動物細(xì)胞培養(yǎng)液是由哪些化學(xué)成分組成的？ 糖、氨基酸、促生長因子、無機(jī)鹽、微量元素等。 4.體細(xì)胞核移植技術(shù)為什么要選擇MII期的卵母細(xì)胞做受體細(xì)胞？ 細(xì)胞核移植技術(shù)中能用作受體細(xì)胞的通常有MII期卵母細(xì)胞和受精卵（合子）。早期核移植技術(shù)中常用受精卵，后來基本上用MII期卵母細(xì)胞取代了受精卵，主要因為兩者的細(xì)胞質(zhì)環(huán)境不同。有人認(rèn)為重組需要的因子存在于MII期卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中，而在原核形成時這些因子已被降解或用光，因此，原核擴(kuò)張后受精卵去核可引起胞質(zhì)中重組因子缺乏。成熟促進(jìn)因子（MPF）是卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中重要的胞質(zhì)影響因子，MPF的活性在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的MI期和MII期達(dá)到最高，受精或激活后，MPF迅速滅活，因此，MII期卵母細(xì)胞中MPF活性高，而受精卵中MPF活性低。MPF水平的高低可影響供體核染色質(zhì)的狀態(tài)和復(fù)制。MII期卵母細(xì)胞細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)已成熟，而MI卵母細(xì)胞細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)尚未成熟，其細(xì)胞質(zhì)不能支持胚胎的全程發(fā)育，因此，盡管MI期卵母細(xì)胞MPF活性也高，但不能用作受體卵母細(xì)胞。 也有人認(rèn)為用去核合子做受體時，可能由于合子去核時一些早期發(fā)育必需的因子隨原核的去除而被去掉了，而使去核受精卵缺乏發(fā)育能力。 因此，目前廣泛采用MII期卵母細(xì)胞做受體。 5.已成功的動物細(xì)胞融合實例還有哪些？ 生物種類 細(xì)胞來源 成功年代 酵母菌—雞 原生質(zhì)體—血紅細(xì)胞 1975年 人—胡蘿卜 腹水癌細(xì)胞—原生質(zhì)體 1976年 人—小鼠 纖維肉瘤細(xì)胞—畸胎瘤細(xì)胞 1978年 要知道更多的實例，需經(jīng)常查閱更多科研報道。 6.為什么不用兩個而要用多個細(xì)胞進(jìn)行動物細(xì)胞間的融合？ 就目前常用的細(xì)胞融合方法來看，不管是用物理的、化學(xué)的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個細(xì)胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細(xì)胞。更重要的是，即使兩個細(xì)胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者期望得到的細(xì)胞類型。目前動物細(xì)胞融合技術(shù)最有價值的應(yīng)用就是單克隆抗體的制備。我們以制備單克隆抗體為例來說明這一問題。我們知道，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達(dá)百萬種以上，但是每一個B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體，如果僅取一個脾細(xì)胞（含B淋巴細(xì)胞）和一個瘤細(xì)胞雜交，我們不能確定該脾細(xì)胞分泌的抗體是否正是我們所需要的；若用大量的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，就可以從融合細(xì)胞中篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。 7.如何進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？ 融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。