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2019-2020年高中生物 專題3《植物的組織培養(yǎng)技術(shù)》教案（1） 新人教版選修1 在《生物技術(shù)實踐》模塊課程標(biāo)準(zhǔn)中，植物組織培養(yǎng)的具體要求是“嘗試植物的組織培養(yǎng)”。嘗試是技能性目標(biāo)中的模仿水平，即學(xué)生仿照教師的示范性動作完成對實驗對象的操作。 植物組織培養(yǎng)是一項操作復(fù)雜而精細，操作難度較大的實踐活動，其操作流程包括：配制母液、培養(yǎng)基配制與滅菌、外植體選擇和消毒、接種、形成愈傷組織、誘導(dǎo)叢芽和生根、組培苗移栽等操作環(huán)節(jié)。從操作的持續(xù)時間看，完成前四項活動需要一天，后三項活動需要1～2個月。為了確保在有限的時間內(nèi)順利地開展實驗教學(xué)，需要確定學(xué)生動手操作的一些重要環(huán)節(jié)和步驟，并針對這些環(huán)節(jié)和步驟提前做好實驗準(zhǔn)備。 1 實驗室的準(zhǔn)備工作 本實驗需要作好三項實驗準(zhǔn)備：一是提前配制各種母液；二是提前準(zhǔn)備MS培養(yǎng)基；三是選擇外植體并進行預(yù)處理。 1.1 配制母液 母液中含有大量元素、微量元素、激素（植物生物調(diào)節(jié)劑）和維生素等有機成分，母液濃度是實際溶液濃度的5～10倍。配制母液花費時間多，需要用到溶量瓶、移液管等精密儀器，無法由每位學(xué)生親自操作，教師可帶領(lǐng)部分學(xué)生在課外進行。母液的類型和配制順序如下： 配制母液的注意事項：⑴自來水或河水中含有大量的礦質(zhì)元素，勿用配制母液；⑵配制大量元素和微量元素母液時，應(yīng)將每種化合物單獨溶解后，再一一混合，同時還應(yīng)用適量的蒸餾水清洗燒杯內(nèi)壁，并將清洗后的蒸餾水倒入混合溶液中，這樣可以保證每種元素的濃度，混合時要按照教材附表中的順序進行，最后加入的是氯化鈣溶液，這樣可以避免發(fā)生沉淀；⑶配制好的母液要先倒入1 000 ml燒杯中，再由燒杯轉(zhuǎn)入1 000 ml細口瓶中，不可由容量瓶直接倒入細口瓶中；⑷注意觀察母液中是否有絮狀物，出現(xiàn)絮狀物表明離子之間發(fā)生反應(yīng)，需要重新配制母液；⑸植物生長調(diào)節(jié)劑難溶于水，需要堿或酸助溶，一般生長素類物質(zhì)用堿（0.1 mol/LNaOH1～3 ml）或酒精（75～95％的酒精1～3ml）助溶，細胞分裂素類物質(zhì)一般用酸（0.1 mol/LHCL1～3 ml）助溶，加入蒸餾水定溶時要緩慢，也可用水浴法助溶；⑹用棕色細口瓶盛裝有機物母液和植物生長調(diào)節(jié)劑母液，避免透射光損害母液中的有機成分；⑺在瓶壁上貼好各種母液的標(biāo)簽（下圖所示）；⑻將配制好的母液放入冰箱中或陰涼處保存。 MS是穆拉希吉（Murashige）和斯庫克（Skoog）兩位科學(xué)家第一個字母的縮寫，他們于1962年為培養(yǎng)煙草而設(shè)計了一種培養(yǎng)基，這就是組培使用中最為廣泛的MS培養(yǎng)基；標(biāo)簽中間一行的數(shù)字及單位表示的意義如下，例如，100ml/L，即配制1升培養(yǎng)基只需從母液中提取100ml即可；50mg/100ml，表明100ml母液中含有50mg萘乙酸，如取4mg的萘乙酸，只需提取8ml母液。 除母液需提前配制好外，消毒液也需要提前配制好。外植體消毒一般采用75％的酒精、2～10％的次氯酸鈉溶液等。 1.2 培養(yǎng)基的配制與滅菌 培養(yǎng)基的類型有很多種，通常采用MS培養(yǎng)基。配制培養(yǎng)基的流程如下： 上述的培養(yǎng)基配制流程中，加入各種母液的時間是在瓊脂溶化之后，這樣既可避免加熱使母液中的各種離子發(fā)生反應(yīng)，又可避免有機物母液和植物生長調(diào)節(jié)劑因高溫受到損害。將母液加入培養(yǎng)基的順序是：先提取大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物母液，后提取植物生長調(diào)節(jié)劑母液，切勿先提取植物生長調(diào)節(jié)劑母液，這是因為該溶液中含有酸或堿，容易與其他元素形成沉淀而失敗。 培養(yǎng)基通常采用高壓蒸汽滅菌，滅菌時間一般為15～20min，滅好菌的培養(yǎng)基不易保存過長時間，通常是現(xiàn)用現(xiàn)配。在對培養(yǎng)基滅菌的同時，也要對解剖刀、鑷子、燒杯、錐形瓶、牛皮紙等必要的儀器設(shè)備進行滅菌。 1.3 外植體的選擇和預(yù)處理 根據(jù)植物細胞的全能性原理，選擇任何活的植物體都能培養(yǎng)出組培苗，但不同植物的各種組織和器官的分裂能力不同，同時還要考慮消毒處理的特殊情況，因此，選擇恰當(dāng)?shù)耐庵搀w進行接種既有利于消毒，避免污染，又有利于在較短時間內(nèi)形成組培苗，從而提高組培成功率。下面是選擇外植體時需要考慮的一些因素及說明。 考慮的因素 說 明 外植體的年齡 一般情況外植體的年齡越小，分化的程度越小，組培的成功率就越高，因此，盡量選擇幼嫩的植物組織或器官作為外植體 外植體的大小 外植體很小和很大都不合適，很小的外植體極容易死亡，很大的外植體不容易消毒，因此，要選擇大小適中的外植體。例如，如果用菊花的芽進行組培，選取的芽可為3mm左右 外植體所在的部位 一般選擇植物的芽尖、根尖或幼嫩的莖作為外植體，這些部位的組織分裂能力強，容易形成愈傷組織 外植體的外觀形態(tài) 由于外植體的消毒工作非常重要，因此，要選擇哪些表面相對光滑容易消毒的外植體較好 選擇好外植體后教師還要做一些預(yù)處理，以便學(xué)生進一步消毒時能有效地殺死外植體表面的微生物。預(yù)處理包括：用清水沖洗；用洗滌靈或洗衣粉清洗；芽作為外植體時要放在錐形瓶中加清水反復(fù)振蕩，如果芽中有很多凹陷，還需要用毛刷輕刷；用自來水細流沖洗2～4小時左右。組培室要進行紫外線消毒，或用化學(xué)藥劑如甲醛和高錳酸鉀進行蒸汽消毒。操作臺、接種器械、工作服等都要提前進行消毒，等等。 2教學(xué)建議 2.1 重視實驗原理的學(xué)習(xí)，幫助學(xué)生形成網(wǎng)絡(luò)化的知識結(jié)構(gòu) 組培的原理及過程是教學(xué)中的重點，對于學(xué)生理解組培在生產(chǎn)實踐中的重要性具有十分積極的現(xiàn)實意義，同時，有助于學(xué)生理解生命的本質(zhì)，以及人類對生命現(xiàn)象進行干預(yù)的意義。組培的原理、過程及作用可用下面的圖示表示。 為幫助學(xué)生理解組培的原理、操作和過程，教學(xué)時可引導(dǎo)學(xué)生討論下列問題：⑴滅菌和消毒的區(qū)別以及在組培中是如何應(yīng)用的？⑵在脫分化和再分化過程中怎樣使用植物生長調(diào)節(jié)劑? ⑶組培過程中有時需要換瓶操作，這是為什么（改變培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度比例）? ⑷組培過程中的每一步都需要光照嗎（愈傷組織的形成不一定需要光照，但叢芽和根的形成需要光照）?⑸組培中用的蔗糖作為能源和原料物質(zhì)，用葡萄糖行不行（使用蔗糖主要是考慮經(jīng)濟因素，也可用葡萄糖或果糖替代）？⑹花藥離體培養(yǎng)獲得的植物幼苗都是單倍體嗎（不是，也有正常的植物體）？等等。 2.2 合理安排時間，確保學(xué)生動手操作關(guān)鍵的步驟 既然我們不可能讓每一位學(xué)生都經(jīng)歷組培的全過程，但又要讓學(xué)生實踐操作，因此，選擇什么樣的操作環(huán)節(jié)讓學(xué)生實踐就顯得尤為重要。以下的幾種方案供參考和借鑒。 方案1：學(xué)生完成外植物體的消毒和接種工作。外植體的消毒工作至關(guān)重要，需要那些操作認(rèn)真、細致的學(xué)生才能夠很好地完成，因此這種方案要求學(xué)生具備一定的操作技能，并且做到耐心、細致。外植體的消毒流程如下。 上述流程中，酒精起到表面消毒的作用，次氯酸鈉溶液的消毒作用更強。這兩種消毒劑的使用時間可根據(jù)外植體的種類決定，一般而言，芽尖等相對幼嫩的組織消毒的時間要短些，而莖、根的消毒時間可用時長一些?？偟脑瓌t是，既要殺滅外植體表面的全部微生物，又要避免損害和殺死外植體本身。除上述的消毒劑外，過氧化氫溶液（10％，5～15min）和氯化汞溶液（0.1～0.5％，2～7min）也是極好的消毒劑。通過以上操作學(xué)生能體會到無菌對于組織培養(yǎng)成功的重要作用，從而提高他們的實驗操作技能、嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真的科學(xué)精神和態(tài)度。 方案2：學(xué)生完成愈傷組織的繼代培養(yǎng)或分化換瓶。由于減少了外植體消毒這一重要的環(huán)節(jié)，操作相對簡單，成功率很高，學(xué)生容易獲得成功的滿足感。因此，這種方案是針對那些實踐操作能力一般的學(xué)生而設(shè)置的。一方面可以讓學(xué)生體驗組培接種的操作過程，另一方面保證了實驗的成功率，節(jié)約了實驗時間。 方案3：探討植物生長調(diào)節(jié)劑的不同濃度對組培的影響。為強凋不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑在誘導(dǎo)愈傷組織分化形成叢芽或生根中的作用，可配制植物生長調(diào)節(jié)劑不同濃度的培養(yǎng)基，然后讓學(xué)生根據(jù)自己的意愿選擇這些培養(yǎng)基進行換瓶操作。當(dāng)學(xué)生看到植物生長調(diào)節(jié)劑的神奇作用時，一定能夠深刻地理解激素對植物生長的重要作用，從而激發(fā)學(xué)生濃厚的探究興趣。下表為組培中常用的植物生長調(diào)節(jié)劑的類型及作用。 調(diào)節(jié)劑 名稱 濃度范圍 作用 生長素類 2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等 0.01～5mg/L 促進細胞的伸長和分裂，促進愈傷組織和根的形成 細胞分裂素類 激動素（KT）、6－芐基腺嘌呤（BA或6－BA）、玉米素（ZT）等 0.5～10mg/L 促進細胞的橫向生長和分裂，促進芽的分化和形成 誘導(dǎo)外植體形成不定芽時，一般用細胞分裂素類物質(zhì)的濃度較高，生長素類物質(zhì)的濃度較低；如果這兩類物質(zhì)的濃度相同，則有利于形成愈傷組織；如果其比值小于1，則有利于生根。教學(xué)中可選擇不同的配比濃度，探討哪種配比濃度更有利于芽的形成，哪種配比濃度更有利于根的形成。 2.3 成立課外活動小組，培養(yǎng)學(xué)生中的積極分子 組培實驗的操作繁多而復(fù)雜，需要教師提前做好大量的準(zhǔn)備工作，因此，成立活動小組，培養(yǎng)學(xué)生中的積極分子十分重要?；顒有〗M主要完成以下工作：（1）幫助老師完成實驗室的前期準(zhǔn)備，如各種母液的配制、各種培養(yǎng)基的配制和滅菌，等等；（2）做好接種的示范操作，并拍成錄像，提供給其他學(xué)生借鑒；（3）接種后的觀察和記錄；（4）進行繼代培養(yǎng)和分化轉(zhuǎn)瓶；（5）幼苗的移栽及管理；（6）進行課題延伸項目的研究，等等。