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分子生物學(xué)研究方法和技術(shù),,本人基本情況,1984年獲湖南農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)學(xué)士學(xué)位。1987年獲中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所理學(xué)碩士學(xué)位，專業(yè):分子遺傳。 1999年11月-200２年11月 受國(guó)家科技部派遣，在日本農(nóng)林水產(chǎn)省北海道國(guó)家農(nóng)業(yè)研究中心博士后特別研究員；主要從事基因定位和功能基因的篩選。 １９８４－１９９９年：主要從事水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理研究；水稻分子育種技術(shù)研究。 １９９９－２０１4：主要從事雜交水稻種子純度快速鑒定技術(shù)研究；水稻品種ＤＮＡ指紋研究；基因定位和分子育種技術(shù)研究。,,1、分子生物學(xué)的發(fā)展歷程 1871年，首次發(fā)現(xiàn)DNA（鮭精DNA）。1943年，證明DNA為遺傳分子，而不是蛋白（1944，O T Avery） 1953年，DNA雙螺旋模型提出（J D Watson（美）和F H C Crick（英），1962年或諾貝爾生理學(xué)、醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）。從而為分子生物學(xué)這一學(xué)科奠基。1961年，合成mRNA，破譯第一個(gè)遺傳密碼（M W Nirenberg（美），1968年獲諾貝爾生理學(xué)、醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）——基礎(chǔ)研究的創(chuàng)新，與推動(dòng)人類文明的進(jìn)步。（以上被稱為理論上的三大發(fā)現(xiàn)）,1970年，分離出第一個(gè)限制性內(nèi)切酶（W Arber（瑞士），1978年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)） 1970年，Baltimore和Temin發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶 ——長(zhǎng)期的基礎(chǔ)研究積累迎來(lái)了突飛猛進(jìn)的高潮。 1973年，Cohen把質(zhì)粒作為基因工程的載體使用 ——基礎(chǔ)研究向應(yīng)用研究的拓展。 （以上被稱為生物工程技術(shù)的的三大發(fā)明）,3個(gè)事例： （1）1976年，重組DNA成功（H Boyer和S N Colen，1981年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）——勇敢的科學(xué)精神。 （2）1982年，美國(guó)一制藥公司在2000升發(fā)酵液中提取出100克精制胰島素。相當(dāng)于從1600磅動(dòng)物胰腺中的提取量——效率、成本、質(zhì)量、競(jìng)爭(zhēng)。 （3）荷蘭最早把分子生物學(xué)產(chǎn)品“豬牛痢疾疫苗”投放市場(chǎng)，比以上美國(guó)的胰島素早半年——后來(lái)居上。,人類對(duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí),20世紀(jì) 個(gè)體 → 染色體 → 基因 →DNA → SNP 生物與非生物間的界限消失了！ 21世紀(jì) 基因克隆，拼結(jié) → 組裝植物、動(dòng)物、嬰兒！,數(shù)、理、化相關(guān)學(xué)科,生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),滲透 交叉,,近代生物學(xué),,個(gè)性,共性,宏觀生物學(xué) （生態(tài)學(xué)為核心）,微觀生物學(xué) （分子生物學(xué)為核心）,,,細(xì)胞水平,分子水平,結(jié)構(gòu)生物學(xué)，發(fā)育生物學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)等新興學(xué)科發(fā)展,,生物多樣性 研究,資源保護(hù)與 利用,人類生態(tài)環(huán)境的保護(hù) 工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)持續(xù)發(fā)展,,現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展,,分子生物學(xué),,,,分子生物學(xué)的延伸,2 分 子 生物 學(xué) 的 概 念,2.1 分子生物學(xué)的定義 2.2 分子生物學(xué)的三大原則 2.3 分子生物學(xué)研究的三大主要領(lǐng)域 2.4 分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科,2.1 分子生物學(xué)的定義,Molecular biology is the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA replication, recombination and translocation. 分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)，是人類從分子水平上真正揭示生物世界的奧秘，由被動(dòng)地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向主動(dòng)地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。,分子生物學(xué)與生物化學(xué)之間的關(guān)系與區(qū)別,分子生物學(xué)—研究生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及信息傳遞過(guò)程，從分子水平研究生命現(xiàn)象。,生物化學(xué)—生物體內(nèi)的化學(xué)運(yùn)動(dòng)，包括化學(xué)組成、變化、結(jié)構(gòu)與功能，生物分子間的物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)換過(guò)程。,分子生物學(xué)≠生物化學(xué),★ 構(gòu)成生物大分子的單體是相同的,★ 生物遺傳信息的表達(dá)的中心法則相同,高級(jí)結(jié)構(gòu),生物大分子之間的互作,,,,2.2 分子生物學(xué)的三大原則,共同的核酸語(yǔ)言 共同的蛋白質(zhì),★ 生物大分子單體的排列（核苷酸，氨基酸）,,,,結(jié) 構(gòu) 生 物 學(xué),,基因分子生物學(xué),,生物技術(shù)理論 論與應(yīng)用,2.3 分子生物學(xué)研究的三大主要領(lǐng)域,狹義的分子生物學(xué)——分子遺傳學(xué),2.4 分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科,1839-1847年 Matthias Schleiden & Theodor Schwann,細(xì)胞的化學(xué)組成，細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞骨架，生物大分子在細(xì)胞中的定位及功能,分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科之一,,,,Gregor Mendel 1864 年,Genetics,Molecular Genetics,,,,Gene structure Gene duplication Gene expression Gene recombination Gene mutation,分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科之二,遺傳因子假說(shuō),Genetics,Biochemistry,,,Nucleic Acid Chemistry,Protein Chemistry,Enzymatic nature of crystalline （晶體） Protein,,Biochemistry,3 21 世 紀(jì) 分 子 生 物 學(xué) 展 望,3.1 自然科學(xué)歷史舞臺(tái)角色的重大變化 3.2 未來(lái)生物學(xué)形成的新熱點(diǎn)及領(lǐng)域 3.3 應(yīng)用生物學(xué)發(fā)展 3.4 21世紀(jì)— 生命科學(xué)的世紀(jì),引導(dǎo)自然科學(xué)向物質(zhì)運(yùn)動(dòng)最高層次突破的帶頭學(xué)科,3.2 未來(lái)生物學(xué)形成的新熱點(diǎn)及領(lǐng)域,生物大分子的高級(jí)三維結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一,生物大分子之間的互作,個(gè)體,細(xì)胞,分子,,,,,整體論,細(xì)胞中的定位,細(xì)胞分化,神經(jīng)基質(zhì) 神經(jīng)通道 信息傳遞,計(jì)算機(jī)語(yǔ)言,分辨，提取，分析， 比較， 預(yù)測(cè)生物信息,生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能信息,基因的識(shí)別與鑒定,基因功能信息的提取與證實(shí),基因表達(dá)譜的繪制 (microarray),,蛋白質(zhì)水平上基因互作的探測(cè),,3.3 應(yīng)用生物學(xué)發(fā)展,生物技術(shù),診斷試劑 治療藥物 植物品種 環(huán)境工程 食品加工 生物塑料 廢物處理 再生能源 ……,3.4 21世紀(jì)—— 生命科學(xué)的世紀(jì),二十一世紀(jì) 生命科學(xué)的世紀(jì),,學(xué)習(xí)分子生物學(xué)的意義,第一章 RNA的分離純化,主要內(nèi)容,前言 一、核酸分離、純化原則 （一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性 （二）防止核酸的生物降解 二、分離提取核酸的主要步驟 （一）細(xì)胞的破碎 （二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除 （三）核酸的沉淀 (四）核酸的濃度測(cè)定 （五）核酸的保存,核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。 無(wú)論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。 核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。,前 言,一、核酸分離、純化原則,（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性 1 意義 遺傳信息全部?jī)?chǔ)存在一級(jí)結(jié)構(gòu)之中，核酸的—級(jí)結(jié)構(gòu)還決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。 2 分離核酸原則： 1）溫度不要過(guò)高； 2）控制一定的pH值范圍(pH值5-9); 3）保持一定的離子強(qiáng)度; 4）減少物理因素對(duì)核酸降解的機(jī)械剪切力.,（二）防止核酸的生物降解,細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)。 所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。,1. DNA酶抑制劑,1） 金屬離子螯合劑： DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉； 2） 陰離于型表面活性劑： 如SDS，該試劑除對(duì)核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。,2. RNA酶（RNAase)抑制劑,RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用機(jī)制：皂土帶負(fù)電荷，能吸附RNase，使其失活。,(2) DEPC(二乙基焦碳酸鹽) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。 作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。 使用注意： 1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。 2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3）提RNA時(shí)，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。 4）劇毒。,（3) 肝素 （4）復(fù)合硅酸鹽（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧釩核糖核苷復(fù)合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC),二 分離提取核酸的主要步驟,（一）細(xì)胞的破碎 1 高速組織搗碎機(jī)搗碎 2 玻璃勻漿器勻漿 3 超聲波處理法 4 液氮研磨法 5 化學(xué)處理法(SDS、吐溫80等） 6 生化法（溶菌酶、纖維素酶等）,（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除 核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。 分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開(kāi)，同時(shí)避免核酸降解。,常用方法： 1. 加入濃鹽溶液（如NaCl） 核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚； 2. 加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來(lái)的功能；,3 . 酚/氯仿抽提 酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對(duì)核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時(shí)氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液時(shí)，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯仿：異戊醇=25：24：1）。,1）使用注意 酚通常是透明無(wú)色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。 2）安全操作 酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。,使用酚時(shí)應(yīng)注意,（三）核酸的沉淀,沉淀是濃縮核酸最常用的方法。 優(yōu)點(diǎn)： ①改變核酸的溶解緩沖液； ②重新調(diào)整核酸的濃度； ③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。,1. 核酸沉淀的鹽類及濃度,2. 有機(jī)沉淀劑,（1）乙醇 優(yōu)點(diǎn)： 對(duì)鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。 缺點(diǎn)： 需要量大，一般要求低溫操作。,（2）異丙醇,優(yōu)點(diǎn)： 需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長(zhǎng)時(shí)間放置。 缺點(diǎn)： 易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次。,（3）聚乙二醇（PEG）,優(yōu)點(diǎn)： 可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用6000相對(duì)分子質(zhì)量的PEG進(jìn)行DNA沉淀時(shí)，使用濃度與DNA片段的大小成反比。 注意： PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。,（4）精胺,精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNA。 原理是： 精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分開(kāi)，達(dá)到純化DNA的目的。,3. 核酸沉淀的溫度和時(shí)間,一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低溫長(zhǎng)時(shí)間下進(jìn)行。低溫長(zhǎng)時(shí)間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。一般使用0℃冰水，10-15min， DNA樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。,(四）核酸的濃度測(cè)定,1. 紫外分光光度法測(cè)定DNA和RNA的含量 前提：核酸樣品要較純，無(wú)顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測(cè)定濃度應(yīng)大于0.25 μg/ml 。 結(jié)論：在波長(zhǎng)260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37 μg/ml；RNA為40 ug/ml。,紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度的操作步驟,a．吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉(zhuǎn)入分光光度計(jì)的石英比色杯中。 b．分光光度計(jì)先用一定量的水校正零點(diǎn)。 c．測(cè)定待測(cè)樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。 d．計(jì)算濃度。 雙鏈DNA樣品濃度(μg/μl) = OD260×核酸稀釋倍數(shù)× 50； RNA樣品濃度(μg/μl) = OD260×核酸稀釋倍數(shù)×40。 e．分析純度。,A：測(cè)DNA： 純的DNA樣品OD260/OD280應(yīng)為1.8，OD260m／OD230應(yīng)大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9時(shí)，表明有RNA污染。 2) 小于1.6時(shí)，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0時(shí)，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注： 可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。,測(cè)定結(jié)果分析,B：測(cè)RNA 純的RNA樣品其OD260／OD280應(yīng)介于1.7-2.0之間，OD260/OD230比值應(yīng)大于2.0。 1）若RNA樣品OD260/OD280比值太小，說(shuō)明有蛋白質(zhì)或酚的污染； 2）比值大于2.0時(shí)，可能被異硫氰酸胍等污染； 3）OD260/OD230比值小于2.0時(shí)表明有小分子及鹽存在。,2. 溴乙錠熒光法測(cè)定核酸的含量,如果DNA和RNA的量很少或有較多雜質(zhì)的情況下，其含量可用溴乙錠熒光法測(cè)定。 原理：DNA、RNA本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可比較出被測(cè)DNA溶液濃度。 注意：此法的比較主要基于目測(cè)，是估計(jì)水平。,（五）核酸的保存,對(duì)DNA保存： ① DNA樣品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存； ② 長(zhǎng)期保存樣品中可加入1滴氯仿。 對(duì)RNA 保存： ①RNA樣品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70 ℃保存; ② 長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯于乙醇中; ③在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。,總RNA提取,目 的 1．了解某一特定組織或細(xì)胞某一特定mRNA轉(zhuǎn)錄量的變化，如PCR、Northern blot等。 2．了解某一特定組織或細(xì)胞全部mRNA轉(zhuǎn)錄量的變化，如DD-PCR、基因芯片等。 3．獲得某一特定組織或細(xì)胞全部mRNA，以便建立cDNA庫(kù)等。 4．獲得某一特定組織或細(xì)胞全部RNA。 以上工作的前提是制備純凈且完整的RNA。,根據(jù)生物學(xué)“中心法則”原理，基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄與翻譯兩個(gè)階段。其中，由DNA到RNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程受到各種因素的調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)水平反映出某種或某些特定的因素對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)能力。 RNA主要由rRNA（占總量的80-85％），tRNA和核內(nèi)小分子RNA（占總量的10-15％）以及mRNA（占總量的1-5％）所構(gòu)成。理論上認(rèn)為每克組織（或108個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞）可提取5-10mg RNA。,提取總RNA的方法有多種，比如： 1) 酚/SDS法 2）采用Trizol試劑盒或類似的方法，稱為一步法，方便而快捷。缺點(diǎn)是RNA的獲得量偏低，質(zhì)量不夠純凈。 3）超離心方法，可以獲得豐富且質(zhì)量高的RNA。缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)時(shí)間比較長(zhǎng)，要求離心過(guò)夜。 4）其它一些試劑盒，主要是利用某些特定的介質(zhì)吸附RNA，洗去其它雜質(zhì)，最后洗脫純凈的RNA。可以在短時(shí)間內(nèi)獲得純凈的RNA。但是價(jià)格比較昂貴。,植物總RNA提取(酚/SDS法 ),材料,液氮 研磨緩沖液：0.18mol/L?Tris 0.09mol/L LiCL 4.5mmol/L EDTA 1%（W/V）SDS 用HCL調(diào)PH至8.2,1mol/L Tris的配法：,在800 雙蒸水中溶解121克Tris堿，用濃鹽酸調(diào)PH值，混勻后加水至1升。,要獲得所需PH值的1M ?Tris HCL，可通過(guò)將一定數(shù)量的10M HCL和1升Tris堿混合，如下表所示:,0.5M EDTA的配制：,在700ML雙蒸水中溶解186.1克Na2EDTA.2H2O，用NaOH調(diào)PH8.0（1000ML 0．5M EDTA需加入20克NaOH），補(bǔ)加雙蒸水至1升。,TLE緩沖液平衡酚 TLE溶液: 0.2mol/L?Tris 0.1mol/L LiCL 5mmol/L EDTA 用HCL調(diào)PH至8.2，用等體積的PH8.0的TLE溶液抽提，然后再用TLE溶液至少抽提2次,氯仿：異戍醇（24：1） 8MOL/L和2MOL/L LICL溶液（DEPC處理，焦碳酸二乙酯） 3MOL/L乙酸鈉（DEPC處理），將408克NaAc.3H2O溶于水，用3MOL/L乙酸調(diào)PH5.2，補(bǔ)加水至1升95%乙醇DEPC處理水,試驗(yàn)步驟：,1、 用液氮冷卻研缽，取15g低溫冷凍的植物組織，迅速置于研缽中，不時(shí)加入液氮以防止研磨過(guò)程中葉片融化，充分研磨后，立即轉(zhuǎn)移到一個(gè)盛有150ML研磨緩沖液和50ml TLE緩沖液平衡酚的500ml離心管中。 2、 加入50ml氯仿：異戍醇，于50℃加熱20 min 。18000g, 4℃，離心20 min。,3、將上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入50ml TLE緩沖液平衡酚的500ml，混勻，再加入50ml氯仿：異戍醇，18000g, 4℃，離心20 min。,4、用 TLE緩沖液平衡酚抽提水相，直至兩面相間界面干凈為止，水相再以氯仿抽提。 5、 吸取上清液，加1/3體積的8M/L LiCL混合至終濃度為2M/L，4℃沉淀過(guò)夜，然后15000g，4℃， 離心20 min，沉淀以2-3ml 2M/L LiCL溶液沖洗。 6、沉淀以5ml水重溶，加入1/3體積的8M/L LiCL混合至終濃度為2M/L，于 4℃深沉RNA兩小時(shí)以上。,7、 15000g，4℃， 離心20 min，沉淀用2ml 2M/L LiCL溶液沖洗，重溶于2ml雙蒸水，加入200ul 3MOL/L乙酸鈉溶液和5.5ml無(wú)水乙醇，-20℃沉淀過(guò)夜或在干冰/乙醇中沉淀30 min。 8、18000g, 4℃，離心15min，沉淀用1ml雙蒸水溶解，取10 ul稀釋至1ml測(cè)OD260和OD280,Trizol試劑盒方法,原 理 本實(shí)驗(yàn)類似于“異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法采用強(qiáng)RNA酶抑制劑異硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白質(zhì)變性。離心后，RNA選擇性地進(jìn)入無(wú)DNA和蛋白質(zhì)的水相。之后通過(guò)異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌等，便可得到較為完整與純潔的總RNA。,實(shí)驗(yàn)步驟 1．取50毫克植物細(xì)嫩組織，加入1ml Trizol液，剪碎，快速勻漿。 2．22℃，靜置5min。 3．加入氯仿0.2ml，顛倒15s。 4．22℃，靜置3min。 5．離心：4℃×15000轉(zhuǎn)/分×15min。 6．取上清液0.45ml。 7．加入0.45ml異丙醇，混勻。,8．22℃，靜置10min。 9．離心：4℃×15000轉(zhuǎn)/分×10min。 10．棄上液。 11．加入1ml 4℃ 75%乙醇。 12．離心：4℃×10000轉(zhuǎn)/分×5min。 13．棄上液，真空干燥5min。 14．用高壓消毒過(guò)的去離子水25ul水冰上溶解，-70℃保存。 15．紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的含量：,取樣本5ul加入石英比色杯內(nèi)，加入蒸水1ml，充分混勻。與蒸鎦水對(duì)照。讀260nm、280nm兩個(gè)測(cè)得值，記錄。計(jì)算： OD260為1時(shí)，為40ug RNA，所以計(jì)算如下： 樣本RNA含量（ug/ul）= OD260*200*40/1000 當(dāng)OD值260/280<1.8時(shí)，提示有蛋白或酚的污染。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果 得到比較純凈的植物組織總RNA。 分光光度計(jì)讀數(shù) 260/280 值為 1.85±0.04。,植物RNA提取中的一些特殊方法,1、多酚類植物的RNA提取： ? ?蘋果、棉花等多酚類植物提取RNA用TRIZOL一般提不出來(lái)。用下述方法提取的RNA純度不是特別高,但是用作northern足夠。 （1）1.5ml離心管用液N2冷凍后加入0.1g樣品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,劇烈振蕩1-2min,冰上放置5min.（2）4 ℃ 12000rpm離心15min, 上清轉(zhuǎn)入新管,加氯仿異戊醇抽提一次（3）取600ul異丙醇,-20 ℃沉淀20min.（4）12000rpm離心10min（5）沉淀用70%乙醇洗（6）8000rpm 5min（7）沉淀晾干,溶于30ulDEPC水,2、 纖維組織： 　　心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關(guān)鍵在于徹底破碎組織。這些組織細(xì)胞密度低，單位重量的組織RNA的含量就少，建議用盡可能多的起始量。使用TRNzol法可以提取纖維組織終RNA，由于纖維組織終RNA含量較少，可按照增加的起始量成比例增加TRNzol的用量，并在液氮中將組織徹底磨碎，同時(shí)適當(dāng)減少溶解RNA的溶液體積。,3、 蛋白/脂肪含量高的組織：動(dòng)物的腦和某些特殊的植物組織中，脂肪或者蛋白的含量很高，可以采用TRNzol來(lái)提取此類樣品中的RNA。在該提取過(guò)程中，用氯仿抽提后，如上清仍含白色絮狀物，必須用氯仿再次對(duì)上清進(jìn)行抽提。使用TRNzol提取脂肪含量高的組織中RNA時(shí)，使用氯仿抽提后會(huì)分成油滴、水相（含RNA）、DNA中間層、有機(jī)相四層，應(yīng)用移液管小心吸取水相液體，避免吸到油滴層和DNA層。,4、 核酸/RNase含量高的組織：　　脾、胸腺、胰臟等組織的核酸和核酸酶含量很高，可以在液氮中碾磨組織，再快速勻漿。如果裂解液太粘稠（因?yàn)楹怂岷扛叩木壒剩?氯仿抽提不能有效分層，可以加入更多裂解液以解決此類問(wèn)題。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成則表明有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提，去除DNA污染。,5、 植物組織和真菌組織： 　　植物組織和真菌組織比動(dòng)物組織更為復(fù)雜，因此為了避免出現(xiàn)內(nèi)源酶作用使 RNA降解的現(xiàn)象，一般選擇在液氮條件下對(duì)植物或者真菌材料進(jìn)行碾磨。如果降解問(wèn)題不能解決，基本上是由于樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導(dǎo)致。許多植物和真菌中的內(nèi)含雜質(zhì)如多糖、多酚等都會(huì)殘留，因?yàn)檫@些雜質(zhì)分子與RNA有一些相似性，可以與RNA同時(shí)沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的RNA提取過(guò)程中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑（RNAplant）來(lái)去除多糖多酚等雜質(zhì)的干擾和污染。,病毒RNA提取方法,異硫氰酸胍提取法:實(shí)驗(yàn)步驟：1、 取200ul樣品數(shù)+陰性對(duì)照+陽(yáng)性對(duì)照個(gè)1.5ml滅菌eppendorf管。2、 加600ul異硫氰酸胍，然后加入對(duì)照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻。3、 13000rpm離心15min。4、 在第3步離心快結(jié)束時(shí)，另取同樣多eppendorf管，加入400ul -20度預(yù)冷的異丙醇。,5、 取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結(jié)束往外拿的時(shí)候，管子盡量不要傾斜）轉(zhuǎn)移到第4步準(zhǔn)備的管中，顛倒混勻。6、 13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體。?7、 加600ul 75％乙醇，顛倒數(shù)次以洗滌殘存異丙醇。,8、 13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體。 9、 4000rpm離心10s，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干，室溫干燥2－3min（不可過(guò)分干燥，防止下一步RNA不溶解）。 10、 加入20ul DEPE水(加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水)，輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5s，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ詈?小時(shí)內(nèi)使用，以免RNA降解）。,RNA提取注意事項(xiàng),一些RNA提取方法，在進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)研究對(duì)象的性質(zhì)，提取核酸的用途而對(duì)上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。1、 在核酸提取時(shí)，為了增加細(xì)胞的裂解度，增加核蛋白復(fù)合體破碎度，以釋放更多的游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在確保沒(méi)有核酸水解酶存在的前提下，酶反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)越好。,2、 有時(shí)在使用蛋白酶時(shí)，為了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL，并且可將反應(yīng)溫度提高到50－60℃，并將反應(yīng)時(shí)間縮短到15－25min，但酶用量必須提高10－20倍。溶菌酶使用時(shí)緩沖液中需加EDTA，因游離金屬離子對(duì)酶有抑制。,3、 許多植物材料中富含酚，在細(xì)胞破碎時(shí)，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的醌類物資，影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量，在提取液中加入PVP和巰基乙醇對(duì)降低酚類的干撓可能有所幫助。PVP將與酚形成復(fù)雜的聚合體，在提取時(shí)將酚從核酸成分中游離。且PVP與巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。,4、 許多生物材料在提取核酸時(shí)，都會(huì)遇到多糖的污染問(wèn)題，具體表現(xiàn)為有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，沉淀很多，但復(fù)溶時(shí)，大量沉淀不溶，電泳觀察時(shí)核酸含量很低。,5、 在核酸提取時(shí)，酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強(qiáng)于氯仿，但酚與水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能損失部分核酸外，水相中還會(huì)殘留酚，而酚的存在將對(duì)核酸的酶反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)的抑制，因此在操作中可單用氯仿作變性劑、也可用酚/氯仿混合變性，也可用單一酚作變性己，但用單一酚后在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)一定要用氯仿從抽提。6、 在操作中當(dāng)加入變性劑氯仿后，為了保證核酸樣品的完整性，操作要輕，尤其在提DNA時(shí)，更要避免劇烈操作。,7、 在沉淀核酸時(shí)可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強(qiáng)于異丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時(shí)，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤其用異丙醇在室溫下沉淀對(duì)擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。 8、 在提取核酸時(shí)，如樣品濃度低，則應(yīng)增加有機(jī)溶劑沉淀時(shí)間，－70℃下>30min;－20℃過(guò)夜將有助于增加核酸的沉淀量。,9、 在核酸提取過(guò)程中有機(jī)溶劑沉淀后復(fù)溶時(shí)可加水因此時(shí)離子濃度可能較高，而到高度純化后低溫保存時(shí)最好復(fù)溶于TE緩沖液中，因溶于TE的核酸儲(chǔ)藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時(shí)要求以高濃度保存，低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解。,10、 核酸提取后可通過(guò)PCR 、RT－PCR直接擴(kuò)增出目的基因片斷，也可首先構(gòu)建文庫(kù)、然后由dd-PCR等差異顯示技術(shù)、AFLP等標(biāo)記技術(shù)、差異雜交或文庫(kù)扣除技術(shù)等方法篩選出特異探針，再用此探針從文庫(kù)中篩選出完整基因。,11、 在抽提過(guò)程中，若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多，可以增加抽提次數(shù).提取RNA請(qǐng)盡量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時(shí)間要盡可能的短。,克服多糖污染可采用以下一些辦法1) CTAB多次抽提。 2) 在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)先稀釋樣品濃度（可到10倍左右），對(duì)低濃度樣品再進(jìn)行沉淀。 3) 在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)選用異丙醇和5MNaCL作為沉淀溶劑，此時(shí)氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體積，異丙醇可用到0.6-1的體積。異丙醇沉淀核酸時(shí)，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，從而可達(dá)到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會(huì)影響核酸的進(jìn)一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。,針對(duì)RNA酶的一些注意事項(xiàng),防止RNA酶污染的措施： 1、 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間。2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。 3、 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。,4、 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。 5、??操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換。 6、 設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。,7、 DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而 含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理8、 加樣原則是DNA最后加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那么采取的方法是算出總體積后加在一個(gè)管子里面，混合均勻之后再分裝到各個(gè)管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染。 9、 普通實(shí)驗(yàn)室容易污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質(zhì)粒制備提取都在同一個(gè)房間里有比較大的關(guān)系，最容易造成高濃度污染的就是產(chǎn)物的開(kāi)蓋和質(zhì)粒的稀釋。因此要格外注意一些。,謝謝！,Thank you,