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中藥有效成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究方法,化合物純度的判定方法1．結(jié)晶均勻、一致。2．固態(tài)：熔點明確、敏銳（0.5~1.0℃）液態(tài)：沸程在5℃以內(nèi)3．TLC(PC):兩種以上不同展開劑展開，均呈現(xiàn)單一斑點。4．HPLC、GC也可以用于化合物純度的判斷。,一、中藥有效成分的理化鑒定物理常數(shù)的測定物理常數(shù)的測定包括熔點、沸點、比旋度、折光率和比重等的測定。固體純物質(zhì)的熔點，其熔距應(yīng)在0.5～1.0℃的范圍內(nèi)，如熔距過大，則可能存在雜質(zhì)，應(yīng)進(jìn)一步精制或另用不同的溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，直至熔點恒定為止。液體物質(zhì)可測定其沸點。液體純物質(zhì)應(yīng)有恒定的沸點，除高沸點物質(zhì)外，其沸程不應(yīng)超過5℃的范圍。此外，液體純物質(zhì)還應(yīng)有恒定的折光率及比重。比旋度也是物質(zhì)的一種物理常數(shù)。中藥的有效成分多為光學(xué)活性物質(zhì)，故無論是已知還是未知物，在鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)時皆應(yīng)測其比旋度。分子式的確定常用質(zhì)譜法，高分辨質(zhì)譜（HR-MS）3.化合物的結(jié)構(gòu)骨架與官能團(tuán)的確定一般首先決定化合物的不飽和度，準(zhǔn)確計算出結(jié)構(gòu)中可能含有的雙鍵數(shù)或環(huán)數(shù)。用化學(xué)法推定分子結(jié)構(gòu)骨架,二、四大光譜在結(jié)構(gòu)測定中的應(yīng)用,紫外—可見光譜（UV-VIS）,紫外—可見光譜（UV-VIS）——共軛體系特征分子中電子躍遷（從基態(tài)至激發(fā)態(tài)）。其中，n-π*、π-π*躍遷可因吸收紫外光及可見光所引起，吸收光譜將出現(xiàn)在光的紫外區(qū)和可見區(qū)（200~700nm）。,,,,,200nm400700nm,紫外區(qū)（UV）可見區(qū)（VIS）,,,應(yīng)用：推斷化合物的骨架類型——共軛系統(tǒng)取代基團(tuán)的推斷如：加入診斷試劑推斷黃酮的取代模式（類型、數(shù)目、排列方式）用于含量測定（以最大吸收波長作為檢測波長進(jìn)行含量測定）,紅外光譜（IR）,分子中價鍵的伸縮及彎曲振動所引起的吸收而測得的吸收圖譜，稱為紅外光譜。,,,,,,,,,40003600300016001000625cm-1,,,特征頻率區(qū)指紋區(qū),特征官能團(tuán)的鑒別化合物真?zhèn)蔚蔫b別,,,羥基（酚羥基、醇羥基）3600~3200cm-1游離羥基~3600cm-1氫鍵締合羥基3400~3200cm-1羰基1600~1800cm-1酮~1710cm-1酯1710~1735cm-1芳環(huán)1600、1580、1500cm-1有2~3個峰雙鍵1620~1680cm-1,兩個化合物完全相同的條件1、特征區(qū)完全吻合2、指紋區(qū)也需完全一致,,,紅外光譜（IR）,紅外光譜對結(jié)構(gòu)的鑒定，主要用于功能團(tuán)的確認(rèn)和芳環(huán)取代類型的判斷。,1H-NMR（核磁共振氫譜）,信息參數(shù)：化學(xué)位移（δ）、峰面積、峰裂分（s、d、t、q、m）及偶合常數(shù)（?）,（1）化學(xué)位移（δC）0~20ppm與1H核所處的化學(xué)環(huán)境（1H核周圍的電子云密度）有關(guān)電子云密度大，處于高場，δ值小電子云密度小，處于低場，δ值大,~0.9-C-CH3,,~1.8-C=C-CH3,~2.1-COCH3,~3.0-NCH3,~3.7-OCH3,11109876543210,,,,,-COOH,-CHO,Ar-H,-C=C-H,常見結(jié)構(gòu)的化學(xué)位移大致范圍,(δppm),推斷化合物的結(jié)構(gòu)（含1H核基團(tuán)的結(jié)構(gòu)）,,（二）峰面積:磁等同質(zhì)子的數(shù)目––用積分曲線面積（高度）表示,磁不等同兩個或兩組1H核在一定距離內(nèi)相互自旋偶合干擾，發(fā)生的分裂所表現(xiàn)出的不同裂分,符合n+1規(guī)律(n=干擾核數(shù)目),用偶合常數(shù)（J）表示,峰裂分的數(shù)目,峰裂分的距離,,不同系統(tǒng)偶合常數(shù)(JHz)大小,s單峰d雙峰t三重峰q四重峰m多重峰,,,,,,,1H-NMR核磁共振輔助技術(shù),（1）重氫(D2O)交換——推斷活潑質(zhì)子（羥基）的存在與否。（2）核增益效應(yīng)（NOE）：指在核磁共振中選擇性照射一種質(zhì)子使其飽和，則與該質(zhì)子在立體空間位置上接近的另一或數(shù)個質(zhì)子信號強度增高的現(xiàn)象。（范例見P31）,13C-NMR（核磁共振碳譜）,信息參數(shù)：化學(xué)位移（δC）碳譜的化學(xué)位移的定義及表達(dá)方式與氫譜一致，所用內(nèi)標(biāo)也一樣，但是化學(xué)位移的幅度較寬，約200個化學(xué)位移單位，故信號之間很少重疊，識別起來比較容易。,不同13C核δC大小與13C核所處的化學(xué)環(huán)境（周圍電子云密度）有關(guān),用于13C核類型的推斷,(δCppm),150~220(c=o),200150100500,c=cAr,50~80(c-o),飽和碳原子（0~60）,主要結(jié)構(gòu)13C核δC的大致范圍,,,化學(xué)位移：大致范圍（δC）0~200ppm,質(zhì)譜（MS）:1．確定分子量（高分辨質(zhì)譜可將分子量精確到小數(shù)點后三位）,計算分子式。2．與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較用于化合物的鑒別（相同條件下，其裂解是符合一定規(guī)律的）。3．依據(jù)裂解特征及碎片離子，推定或復(fù)核未知化合物分子的部分結(jié)構(gòu)。,電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS）,但對于熱敏成分及難于氣化的成分（醇、糖苷、部分羧酸等）大分子物質(zhì)（多糖、肽類）難以氣化,測不到分子離子峰亦無法測得分子量,,對熱不穩(wěn)定性的化合物乙?；蛉谆柰榛═MS化）制成熱穩(wěn)定性好的揮發(fā)性衍生物進(jìn)行測定,(2)化學(xué)電離質(zhì)譜CI-MS(3)場致電離FI-MS(3)場解析質(zhì)譜FD-MS(4)快原子轟擊質(zhì)譜FAB-MS(5)電噴霧電離質(zhì)譜ESI-MS,電離新方法（樣品不必加熱氣化而直接電離）,第1節(jié)苷類的結(jié)構(gòu)研究,苷類結(jié)構(gòu)研究的一般程序：1.物理常數(shù)的測定。Mp.[ａ]等。2.分子式的測定——質(zhì)譜分析法（廣泛采用）電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS）：不易獲得分子離子峰（極性大）化學(xué)電離質(zhì)譜（CI-MS）場解吸質(zhì)譜（FD-MS）：常用快原子轟擊質(zhì)譜（FAB-MS）：常用高分辨快原子轟擊質(zhì)譜（HR-FAB-MS）：能直接測出分子式,3.組成苷的苷元、糖的鑒定,（1）苷元的結(jié)構(gòu)鑒定（見各章節(jié)）（2）糖的種類鑒定紙色譜（PC）：分配原理，BAW系統(tǒng)，與對照品共色譜鑒定薄層色譜（TLC）：硅膠（硼酸溶液或無機鹽溶液制-增加上樣量）氣相色譜（GLC）：水解、制備TMS衍生物（具揮發(fā)性），用對照品tR鑒定NMR光譜：苷中各糖的不同質(zhì)子的δ、J與標(biāo)準(zhǔn)糖數(shù)據(jù)進(jìn)行比較鑒定苷中各糖的不同碳原子的δ與標(biāo)準(zhǔn)糖數(shù)據(jù)進(jìn)行比較鑒定,（3）糖的數(shù)目的測定,光密度掃描法測定各糖斑點含量，計算各糖分子比，推算組成苷的糖的數(shù)目質(zhì)譜法測定苷及苷元的分子離子峰（分子量），計算其差值，求出糖的數(shù)目1H-NMR譜:端基質(zhì)子的信號（δ大-處于低場）數(shù)目或者全乙?；蛉谆镆阴Ｑ趸⒓籽趸盘枺é?、J）的數(shù)目13C-NMR譜:端基碳原子信號（δ90～112ppm）的數(shù)目或者苷分子總碳信號數(shù)目減去苷元的碳信號數(shù)目,推算糖的數(shù)目,4.苷元與糖、糖與糖之間連接位置的測定,（1）苷元與糖之間連接位置的測定13C-NMR譜法：利用苷化位移規(guī)律，將苷與苷元的碳譜相比較即可鑒別醇羥基苷化，苷元α-碳向低場位移（δ+4～10ppm），β-碳向高場位移（-0.9～-4.6ppm）酚羥基苷化，苷元α-碳向高場位移，β-碳向低場位移,化學(xué)方法:將苷的全甲基化物進(jìn)行甲醇解，鑒定（與對照品共色譜）未全甲醚化的單糖，游離羥基所在位置即糖與糖之間的連接位置。,（2）糖與糖之間連接位置的測定,13C-NMR譜法：利用苷化位移規(guī)律，將苷與相應(yīng)單糖的碳譜數(shù)據(jù)相比較即可鑒別。糖與糖相連，內(nèi)端糖連接糖的碳原子移向低場（δ4～7ppm）相鄰碳原子移向高場（δ-1～-4ppm）,5.苷中糖與糖之間連接順序的確定,苷,緩和酸水解酶解乙酰解全甲基化甲醇解,部分苷鍵斷裂的裂解產(chǎn)物,,,,,,分析推斷,波譜分析法,質(zhì)譜（MS）法：主要利用質(zhì)譜中歸屬于有關(guān)糖基的碎片離子峰或各種分子離子脫糖基的碎片離子峰，可對糖的連接順序作出判斷。EI-MS：(需作成全甲基化、乙?；蛉谆杳鸦?常見各單糖及雙糖的全乙?；?、TMS衍生物碎片離子峰見書。FD-MS或FAB-MS：常出現(xiàn)各種脫去不同程度糖基的碎片離子峰。,6.苷鍵構(gòu)型的確定,（1）利用酶水解法——(酶的專屬性)（2）利用開勒（Klyne）經(jīng)驗公式進(jìn)行計算Δ[M]D=[M]D苷-[M]D苷元,,與各糖的一對甲苷（α-、β-）的分子比旋度相比較，與α-甲苷接近，則該苷鍵構(gòu)型為α-構(gòu)型與β-甲苷接近，則該苷鍵構(gòu)型為β-構(gòu)型,1H-NMR利用端基質(zhì)子偶合常數(shù)的大小判斷苷鍵構(gòu)型,,依據(jù),相鄰碳原子上質(zhì)子偶合常數(shù)的大小與二者之間的立體夾角有關(guān),H-2ˊ為ａ鍵的糖（葡萄糖、木糖、半乳糖）,H-2ˊ為e鍵的糖（鼠李糖、甘露糖）,ａ-苷鍵β-苷鍵ａ-苷鍵β-苷鍵J1ˊ2=2～3.5HzJ1ˊ2ˊ=6～9HzJ1ˊ2ˊ=2HzJ1ˊ2ˊ2Hz(Jae、Ф60O)（Jaa、180）（Jee、60）（Jae、60O）,J1ˊ2ˊ不相等J1ˊ2ˊ相等,意義,可以用于構(gòu)型的判斷不能用于構(gòu)型的判斷,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,（3）利用核磁共振（NMR）確定苷鍵構(gòu)型,ａ-D-葡萄糖苷ａ-L-鼠李糖苷J(rèn)1ˊ2=Jae=2～3HzJ1ˊ2=Jae=2Hz,β-D-葡萄糖苷β-L-鼠李糖苷J(rèn)1ˊ2=Jaa=6～9HzJ1ˊ2=Jae=2Hz,,,如表3-4，利用端基碳原子的化學(xué)位移判斷苷鍵構(gòu)型，除D-甘露糖、L-鼠李糖外，絕大多數(shù)單糖甲苷，其α-型與β-型的化學(xué)位移相差4ppm。如表3-5利用端基碳原子與端基質(zhì)子的偶合常數(shù)判斷苷鍵構(gòu)型α-甲苷J(rèn)C1-H1≈170Hzβ-甲苷J(rèn)C1-H1≈160HzΔδ10ppm,13C-NMR譜：,例題：確定苷鍵構(gòu)型的方法為（）A．利用Klyne經(jīng)驗公式計算B．1H-NMR中，端基氫偶合常數(shù)J=6～8Hz為β-構(gòu)型，J=3～4Hz為α-構(gòu)型。C．1H-NMR中，端基氫偶合常數(shù)J=6～8Hz為α-構(gòu)型，J=3～4Hz為β-構(gòu)型。D．13C-NMR中，端基碳與氫偶合常數(shù)J=160Hz為β-構(gòu)型，J=170Hz為α-構(gòu)型。E．13C-NMR中，端基碳與氫偶合常數(shù)J=160Hz為α-構(gòu)型，J=170Hz為β-構(gòu)型。,,一、化學(xué)方法（輔助手段）二、波譜技術(shù)：包括UV、IR、NMR、MS等四大光譜技術(shù)。目前已成為醌類化合物結(jié)構(gòu)研究主要技術(shù)手段。尤其在樣品量比較少的情況下，波譜技術(shù)為首選方法。特別是核磁共振技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)。,第2節(jié)醌類化合物的結(jié)構(gòu)研究,一．化學(xué)方法,1．鋅粉干餾：母核推斷2．氧化反應(yīng)：取代基推斷3．衍生物制備：甲基化物、乙?；?羥基蒽醌（ａ-OH、β-OH、醇OH、羧基）羥基數(shù)目、位置*甲基化試劑的選擇性反應(yīng)**（乙?；噭┩茢嘣胤治龌虿ㄗV分析（NMR）甲基化產(chǎn)物確定甲氧基數(shù)目（乙酰化產(chǎn)物）（確定乙?；鶖?shù)目）,,,,1、紫外可見（UV）光譜：共軛特征2、紅外光譜（IR）:官能團(tuán)特征3、核磁共振（13C譜）:分子骨架（1H譜）:基團(tuán)特征4、質(zhì)譜（MS）：分子量（M+.）,二．波譜分析,苯醌～240nm強峰～285nm中強峰～400nm弱峰,（苯甲酰基）245nm251nm335nm,萘醌,(醌樣結(jié)構(gòu))257nm,,（1）醌類化合物的紫外光譜特征,苯甲?；?52nm325nm,醌式結(jié)構(gòu)：272nm405nm,蒽醌母核的紫外光譜：,羥基蒽醌：,第一峰與羥基數(shù)目的關(guān)系：,第五峰與結(jié)構(gòu)的關(guān)系：,羰基苯環(huán)羥基（1675～1653cm-1）(1600～1480cm-1)(3600～3130cm-1),羥基蒽醌,,,,,,,,羰基與羥基(α-OH)締合的影響,,羥基蒽醌紅外光譜（IR）特征：,（2）紅外光譜（IR）,締和羥基,締和羰基,游離羥基游離羰基,,吸收峰向低波數(shù)位移,游離羰基（高波數(shù)）游離羥基（β-OH）（3600～3150cm-1）締合羰基（低波數(shù)）締合羥基（α-OH）（3150cm-1以下）,,,,,羰基峰的數(shù)目、位置與α-羥基的數(shù)目及位置有關(guān),,α-羥基數(shù)目及位置對羰基頻率的影響：,3.核磁共振氫譜(1H-NMR譜),(1)醌環(huán)上質(zhì)子,醌環(huán)質(zhì)子（2、3、5、6）δ6．72（ｓ）,,芳環(huán)質(zhì)子δ8.06(ａ-H,5、8)δ7.73(β-H,6、7),醌環(huán)質(zhì)子δ6.95(ｓ),,(2)芳環(huán)上質(zhì)子,萘醌,苯醌,蒽醌芳環(huán)上質(zhì)子：,ａ-H（1、4、5、8）δ8.07β-H（2、3、6、7）δ7.67,蒽醌,(3)取代基質(zhì)子的化學(xué)位移及對芳環(huán)質(zhì)子的影響,甲基質(zhì)子δ2.1～2.9（ｓ或?qū)挘螅ü╇娀?，δ鄰芳?xì)?0.15）,（大黃素）,α-OH質(zhì)子δ11～12δ鄰、對芳?xì)?0.45,β-酚羥基質(zhì)子（ｓ）δ160ppm)C-7(C-OH,s.δ>160ppm)，受羰基吸電共軛的影響C-9(季碳，C-O-,s.δ149.0～154.0ppm)C-10(季碳，s.δ110.0～113.0ppm)C-4(C=C,d.δ143.0～145.0ppm)，受羰基吸電共軛的影響C-3(C=C,d.δ110.0～113.0ppm)δC-2>C-7>C-9>C-4>C-5>C-6≈C-3≈C-10>C-8160以上110.0～113.0110以下,13C-NMR譜特征：,（2）出現(xiàn)一系列失去CO的碎片離子峰，最主要碎片離子峰是[M-CO]+峰。,（3）具有甲氧基取代的香豆素經(jīng)常出現(xiàn)失去甲基（-CH3）的碎片離子峰。,4．質(zhì)譜（MS）特征,（1）大多具有很強的分子離子峰[M]+，簡單香豆素和呋喃香豆素的分子離子峰經(jīng)常是基峰。,花椒毒內(nèi)酯質(zhì)譜裂解途徑,一.紫外可見光譜在黃酮類化合物結(jié)構(gòu)測定中的應(yīng)用一般鑒定程序：1、先測定在甲醇中的光譜。2、再測定在加入各種診斷試劑后的紫外光譜。3、如為苷類，則可水解或甲基化后再水解，并測定苷元或其衍生物的紫外光譜。4、將以上各種光譜數(shù)據(jù)（或光譜圖）進(jìn)行對比分析，即可獲得有關(guān)結(jié)構(gòu)信息。,第4節(jié)黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)研究,,,,,,,,黃酮（醇）：帶II、帶I均強母核光譜特征二氫黃酮類、異黃酮類：帶II強、帶I弱母核的推斷（甲醇）查耳酮、橙酮：帶II弱、帶I強,取代基：OH等，為助色團(tuán)依紅移規(guī)律推斷取代基團(tuán),,甲醇鈉：強堿，所有酚羥基解離醋酸鈉：堿性弱，酸性強的酚羥基解離加入診斷試劑醋酸鈉/硼酸：鄰二酚羥基絡(luò)和相應(yīng)吸收峰紅移,三氯化鋁：3-OH，4-羰基5-OH，4-羰基絡(luò)和鄰二酚羥基,,,,,黃酮類化合物在甲醇中紫外光譜特征,,,苯甲酰系統(tǒng)桂皮酰系統(tǒng)（帶II220~280nm）（帶I300~400nm）黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中的交叉共軛體系,,二氫黃酮（醇）異黃酮（二氫）（由B環(huán)產(chǎn)生的桂皮酰系統(tǒng)不存在，帶I弱，帶II強）,,,,黃酮類化合物在甲醇中紫外光譜特征,,黃酮類化合物母核UV吸收特征,,母核類型帶II（nm）帶I（nm）備注黃酮250~280（強）304~350（強）典型的交叉共軛系統(tǒng)黃酮醇（3-OH游離）250~280（強）358~385（強）3-OH供電共軛↑，帶1紅移黃酮醇（3-OH取代）250~280（強）328~357（強）3-OH供電減弱，使黃酮,,,,異黃酮245~278（強）(sh)桂皮酰系統(tǒng)破壞二氫黃酮（醇）270~295（強）(sh)查耳酮220~270（弱）340~390（強）橙酮230~270（弱）370~430（強）花青素（苷）270~280465~560（可見區(qū)）,,,（2）取代基團(tuán)對共軛吸收的影響,黃酮類核中引入-OH（酚羥基）等供電基團(tuán)，使共軛程度增強，相應(yīng)的吸收峰紅移。一般，A環(huán)引入–OH，帶II紅移，B環(huán)引入–OH帶I紅移。羥基甲基化或苷化后，原酚羥基的供電能力下降，引起相應(yīng)的吸收峰紫移。3-OH甲基化或苷化，帶I紫移，5-OH（與羰基形成分子內(nèi)氫鍵）甲基化，帶I、帶II均紫移5~15nm，4′-OH甲基化，帶I紫移3~10nm。羥基乙?；?，乙?；奈娮饔?，使原來酚羥基對共軛系統(tǒng)的供電能力消失，對光譜的影響亦將完全消失。,黃酮、黃酮醇加入診斷試劑后吸收峰（帶I、帶II）的位移規(guī)律診斷試劑位移規(guī)律歸屬,NaOMe帶I紅移40~60nm，強度不降示有4′-OH帶I紅移50~60nm，強度下降示有3-OH、但無4′-OH,NaOAc帶II紅移5~20nm示有7-OH,2.加入診斷試劑后引起的位移及其在結(jié)構(gòu)測定中的意義,NaOAc/H3BO3帶I紅移12~30nm示B環(huán)有鄰二酚羥基帶II紅移5~10nm示A環(huán)有鄰二酚羥基（不包括5，6-鄰二酚羥基）,,,,,,,,診斷試劑位移規(guī)律歸屬,,,AlCl3及AlCl3/HClAlCl3/HCl譜圖=AlCl3譜圖示無鄰二酚羥基AlCl3/HCl譜圖≠AlCl3譜圖示可能有鄰二酚羥基AlCl3/HCl譜較AlCl3譜帶I紫移30~40nm示B環(huán)有鄰二酚羥基若紫移20nm示B環(huán)有鄰三酚羥基帶I紫移50~65nm示A、B環(huán)均可能有鄰二酚羥基AlCl3/HCl譜圖=MeOH譜圖示無3-及5-OHAlCl3/HCl譜圖≠MeOH譜圖示可能有3-及/或5-OH帶I紅移35~55nm示只有5-OH無3-OH僅紅移17~20nm示除5-OH外，尚有6-含氧取代紅移50~60nm示可能同時有3-OH及5-OH,,異黃酮、二氫黃酮（醇）的吸收峰（帶II）位移規(guī)律,NaOAc異黃酮帶II紅移6~20nm示有7-OH二氫黃酮（醇）帶II紅移34~37nm示有5，7-二OH帶II紅移51~58nm示有7-二OH,AlCl3/HClAlCl3/HCl譜圖與甲醇中的譜圖比較異黃酮帶II紅移10~14nm示有5-OH二氫黃酮（醇）帶II紅移20~26nm示有5-OH,,診斷試劑位移規(guī)律歸屬,,,,,查耳酮、橙酮的吸收峰（帶I）位移規(guī)律,NaOMe查耳酮帶I紅移60~100nm，強度增加示有4-OH帶I紅移60~100nm，強度不增加示有2-或4′-OH橙酮帶I紅移70~95nm，示有或6-OH,AlCl3及AlCl3/HCl查耳酮、橙酮（AlCl3較AlCl3/HCl譜圖）帶I紅移40~70nm示有B-環(huán)鄰二酚羥基查耳酮（AlCl3/HCl譜圖較MeOH譜圖）帶I紅移40~60nm示有2′-OH,,診斷試劑位移規(guī)律歸屬,,,,,,二．1H-NMR譜在黃酮結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用,測定溶劑：CCl4-樣品需制備成三甲基硅醚化衍生物，不能顯示羥基質(zhì)子特征，目前已基本不被采用。DMSO-d6-樣品（苷、苷元）不需制備成衍生物，可以顯示各酚羥基質(zhì)子特征。,,,,,,,,A環(huán)質(zhì)子B環(huán)質(zhì)子C環(huán)質(zhì)子糖上質(zhì)子取代基團(tuán)質(zhì)子,芳環(huán)質(zhì)子芳環(huán)質(zhì)子與類型有關(guān)端基質(zhì)子-OH、-CH3、其它質(zhì)子-OCH3、,,-OCOCH3,黃酮類化合物各質(zhì)子的信號特征（δ、峰形狀、J、峰面積）,,,δ6~8ppm，B-H位于較低場δ5-H最大8.0ppm（羰基去屏蔽）δA-H5.7~7.95-OHδ12.40δB-H6.5~7.97-OHδ10.93,,,,,,,,,,,1H-NMR譜在黃酮結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用,J鄰6~9Hz3-OHδ9.70J間2~3Hz4’-OHδ(10.01)J對0~1Hz（不計）3’-OHδ(9.42)峰形狀及J與取代有關(guān)-OCH3δ3.5~4.10(3Hs),6-CH3δ2.04~2.27(3Hs),8-CH3δ2.14~2.45(3Hs)A-環(huán)B-環(huán)-OCOCH3(羥基乙?；?5，7-二OH4′-氧取代糖上δ1.65~2.10(3Hs)7-OH取代3′，4′-氧取代苷元δ2.30~2.50(3Hs),3′，4′，5′-氧取代glu,H-1″位于低場δ較大4.8~5.70ppm依δ、峰形（d、dd）、J苷元-3-O-gluδ5.80左右（1H.d.）J與構(gòu)型有關(guān)Jaa=6~9Hz，Jae=2~3A、B-環(huán)取代方式推斷苷元-5、7、4′-O-gluδ5.0左右rhaC-CH3δ0.8~1.20(d/m),,,,,,,,,,,,黃酮H-3δ6.30（1H，s）黃酮醇C-環(huán)無質(zhì)子異黃酮H-27.6~7.80（1H，s）受1-氧原子和4-羰基吸電影響,δ較大二氫黃酮H-2δ中心5.2(1H,dd.Jaa=11.0Hz,Jae=5.0Hz)兩個H-3δ中心2.8(1H,dd.J偕=17.0Hz,Jaa=11.0Hz)(1H,dd.J偕=17.0Hz,Jae=5.0Hz)二氫黃酮醇H-2δ4.8~5.0（1H，d.Jaa=11.0Hz）H-3δ4.1~4.3（1H，d.Jaa=11.0Hz）查耳酮H-aδ6.7~7.40(1H,d.J反=17.0Hz)H-βδ7.0~7.70(1H,d.J反=17.0Hz)橙酮=CHδ6.5~6.70（1H，s）,,,,,,,取代基團(tuán),1H-NMR譜在黃酮結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用,三．13C-NMR譜在黃酮類化合物結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用,,,推斷黃酮類化合物的骨架類型,（一）黃酮類化合物骨架類型的判斷利用13C-NMR譜中黃酮類化合物的中央三個碳核信號的位置以及它們在偏共振去偶譜中的裂分情況,13C-NMR譜中黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中的中央三碳核的信號特征,C=OC-2（或C-β）C-3（或C-a）歸屬,174.5~184.0(s)160.5~163.2(s)104.7~111.8(d)黃酮類147.9(s)136.0(s)黃酮醇類149.8~155.4(d)122.3~125.9(s)異黃酮類182.5~182.7(s)146.1~147.7(s)111.6~111.9(d)橙酮類(=CH-)188.0~197.0(s)136.9~145.4(d)116.6~128.1(d)查耳酮類75.0~80.3(d)42.8~44.6(t)二氫黃酮類82.7(d)71.2(d)二氫黃酮醇類,,,,,,（二）黃酮類化合物取代圖式的確定利用黃酮類化合物中芳香碳原子（A-環(huán)碳原子、B-環(huán)碳原子）的信號特征,確定取代基的取代圖式,,,黃酮母核13C-NMR信號歸屬,,推斷取代基（X）的連接位置依取代基的位移效應(yīng)規(guī)律(B-環(huán)),,XZiZoZmZp,-OH+26.0-12.8+1.6-7.1,-OCH3+31.4-14.4+1.0-7.8,確定5，7-二OH取代黃酮圖式依5，7-二OH黃酮中的C6和C8信號特征δ90~100ppm范圍內(nèi)δC6>δC8,確定糖與苷元的連接位置依苷化位移規(guī)律,苷元（酚羥基）：a-C移向高場，δ降低鄰、對位-C移向低場，δ增大糖（酚苷）：δ端基碳原子+4.0~6.0ppm,,,,,,,,,,四．MS在黃酮類化合物結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用,黃酮類化合物MS特征——測定分子量（M+）,取代基團(tuán)推斷（碎片離子峰）,苷元（極性?。┸眨O性大、難氣化、與熱不穩(wěn)定）,,EI-MS（以前）：苷看不到，須制備成衍生物方能測得很弱的分子離子峰FD-MS、FAB-MS、ESI-MS（目前）：可測得分子離子峰或準(zhǔn)分子離子峰[M+1]、[M+23]等。,,,,,,,可以測的分子離子峰，且常為基峰,EI-MS裂解規(guī)律1．分子離子峰為基峰—用于測定分子量。2．主要碎片離子峰為裂解途徑I和裂解途徑II。,,黃酮類化合物結(jié)構(gòu)MS,裂解途徑I（RDA裂解）：,裂解途徑II：,通常，上述兩種基本裂解途徑是相互競爭、相互制約的。并且，途徑I裂解產(chǎn)生的碎片離子豐度大致與途徑II裂解產(chǎn)生的碎片離子的豐度互成反比。,黃酮類化合物結(jié)構(gòu)MS,,.,,兩種途徑裂解得到的碎片離子A1、B1、B2等，保留著A-環(huán)、B-環(huán)的基本骨架，且碎片A1與相應(yīng)的B1碎片的質(zhì)荷比之和等于分子離子的質(zhì)荷比。,母核推斷A、B-環(huán)取代情況確定,3.其他碎片離子峰還有[M-H]+、[M-CO]+、[M-CH3]+（含甲氧基）、[A1+H]、[A1-CO]、[B2-CO]等碎片離子。,+,黃酮類基本裂解途徑(以途徑-I為主）,途徑I+H轉(zhuǎn)移,途徑II,途徑I,黃酮醇類基本裂解途徑（以途徑-II為主）,途徑I＋H轉(zhuǎn)移,途徑-II,