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2012年度碩士論文答辯,論文題目：腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像學位申請人：羅冬梅專業(yè)名稱：光學研究方向：生物組織的二次諧波成像所在院系：生物光子學研究院導師姓名和職稱：金鷹副教授2012.06.04,contents,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,SHG于1961年首次被Franken發(fā)現：當兩個具有相同基頻的光子同時與具有非對稱結構的樣品相互作用時，散射產生恰好雙倍于激發(fā)頻率的二次諧波光信號（半波長，雙倍能量）。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究背景和內容,實驗原理、裝置和流程,DNA樣品的SHG成像結果,討論,總結和展望,,SHG成像特點對生物組織無光損傷和光致毒。SHG具有高度的方向性。無需外源性標定物即可實現成像。SHG顯微成像不受前向發(fā)射性質的限制，可以與其它顯微成像裝置聯合成像，如TPEF、OCT等聯合使用，進行成像比較，實現信號互補。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,SHG在生物學領域的應用,,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究內容：利用TPEF/SHG光譜學成像技術對不同DNA樣品進行檢測，來獲取DNA樣品（基因組DNA溶液、細胞核提取物以及培養(yǎng)細胞的細胞核）的SHG信號并進行高解析度成像。在實驗結果的基礎上通過對培養(yǎng)細胞添加少量的乙醇（體積比小于5%）可以得到SHG信號。在此基礎上，探討乙醇對DNA構象的影響。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,介質在強激光作用下，電極化強度與入射輻射的場強E之間的關系可以表示為：P=χ(1)E+χ(2)E2+χ(3)E3χ(1)是介質的一階線性極化率；χ(2)和χ(3)分別表示介質的二階、三階非線性極化率；χ(2)E2正是二次諧波和雙光子熒光激發(fā)等二階非線性光學產生的根源。SHG的產生與介質的二階非線性極化率的存在率有關，χ(2)不為零。χ(2)與材料本身的特性有關，它反映了分子的中心對稱性、介質分子排列和取向等細微結構。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究背景和內容,實驗原理、裝置和流程,DNA樣品的SHG成像結果,討論,總結和展望,二次諧波的產生條件：（1）非中心對稱結構（2）相位匹配,,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,相位匹配傳播中的基波和不斷產生的倍頻極化波之間保持相位一致，相互干涉，當相位完全匹配時產生的二次諧波輸出功率最大。實際上就是要求入射光與二次諧波倍頻光在介質中的折射率相等（即傳播速度相同）。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,鈦寶石飛秒激光器發(fā)出的超短脈沖激光通過聲光調制器后到達雙光子激光掃描顯微鏡作為激發(fā)光，經過主二向色性光束分束器由油浸物鏡聚焦到樣品上，樣品在基頻光激發(fā)下產生背向二次諧波再經油浸物鏡收集，經過紅外光束濾色片濾除漫反射的基頻光后將激發(fā)光輸送到META探測，由探測器探測后轉變?yōu)殡娦盘杺鬏斨劣嬎銠C。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,人肝癌細胞系BEL-7420購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。,細胞傳代培養(yǎng),基因組DNA、細胞核的提取,,SHG成像,,,,培養(yǎng)腫瘤細胞提前一天接種于共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,基因組DNA溶液的發(fā)射光譜,,,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究背景和內容,實驗原理、流程和裝置,DNA樣品的SHG成像結果,討論,總結和展望,細胞核提取物的成像與光譜,基因組DNA溶液的發(fā)射光譜,細胞核提取物的發(fā)射光譜,,,,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,培養(yǎng)細胞的SHG/TPEF成像,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,,,結論：基因組DNA和細胞核提取物DNA均能產生SHG信號，且細胞核提取物的SHG/TPEF信噪比明顯高于基因組DNA的SHG/TPEF信號。常規(guī)狀態(tài)下幾乎觀測不到來自培養(yǎng)細胞的細胞核核區(qū)的SHG信號。通過在培養(yǎng)基中添加少量無水乙醇（體積比小于5%），可以在培養(yǎng)細胞的細胞核區(qū)域檢測到SHG信號。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,DNA產生二次諧波的原因：（1）DNA由核苷酸分子構成，核苷酸是手性分子，滿足非中心對稱結構；（2）DNA的反向平行的雙螺旋結構在一定的電場激發(fā)下，能夠實現相位匹配，滿足產生SHG的產生條件。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究背景和內容,實驗原理、流程和裝置,DNA樣品的SHG成像結果,討論,總結和展望,在真核細胞中，DNA以非常致密的形式存在于細胞核中；基因組DNA是以線性雙鏈的形態(tài)的存在于溶液中，DNA致密程度遠低于細胞核DNA。,基因組DNA的SHG/TPEF信噪比低于細胞核DNA的原因：,,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,在細胞中DNA主要以B型構象存在，也包括Z型和A型構象。,乙醇誘導DNA構象發(fā)生改變對于添加酒精后培養(yǎng)細胞中出現SHG信號，我們推測是由于乙醇的加入改變了培養(yǎng)細胞DNA的分子構象，導致DNA的某些光學特性發(fā)生了變化，從而引起SHG的產生。,,DNA構象影響因素：（1）溶劑極性；（2）介電常數；（3）粘度；（4）離子濃度,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,當加入乙醇到DNA溶液中，使得溶液中水活性降低，致使結合到DNA上的水分子數減少，原來被水分子支撐而伸展的DNA溝槽收縮，大溝槽變得更窄更深，小溝槽變得更寬更淺，使得DNA整體外形變得更短，從而導致DNA構象由B型向A型轉變，這種轉變將改變雙螺旋結構中大溝槽和小溝槽的氫鍵類型。,,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,DNA隨著乙醇濃度的增大穩(wěn)定性會降低，推測當加入乙醇到培養(yǎng)的細胞中，乙醇小分子會通過核孔進入到細胞核內，致使DNA的穩(wěn)定性降低從而使DNA與蛋白質的結合松散，使雙鏈處于較松散的狀態(tài)，有利于DNA與RNA結合致使構象發(fā)生改變。,松散狀態(tài)的DNA,DNA與RNA結合,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,反射式背向二次諧波信號強度由以下公式決定：,由上式可知二次諧波信號強度與介質的二階非線性極化率有關。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,二階非線性極化率又與材料本身的特性有關：它反映了介質分子的中心對稱性、介質分子排列和取向等細微結構。推測有可能乙醇的加入造成的DNA構象的轉變使得DNA分子的二階非線性極化率χ(2)發(fā)生變化，繼而導致介質的二次諧波加強，實驗結果再次說明了二次諧波對生物組織的微觀結構的變化極其敏感。,,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,在活細胞中，由于細胞本身不滿足非中心對稱結構，每個核苷酸分子產生的二次諧波相互疊加抵消使得我們在實驗中并未觀測到SHG的產生。當加入乙醇分子后，DNA分子表面的電荷特性發(fā)生改變以及分子的螺旋構象形態(tài)發(fā)生改變，使得每個分子在同樣入射光的的激發(fā)下所產生的超極化強度與之前相比發(fā)生改變，在我們觀察的生物組織區(qū)域內，所有的二次諧波相位一致而相互干涉加強，滿足相位匹配原理，使得我們在加入乙醇后觀察到了SHG。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,由此，反推基因組DNA和細胞核提取物中SHG的產生，由于在提取這兩種物質的過程中添加了乙醇，乙醇的加入也會影響DNA的構象，對二次諧波的產生和增強造成一定的影響。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,總結：本論文圍繞光學非線性成像技術在生物組織成像中的應用進行展開，討論了基于DNA樣品的二次諧波（SHG）的非線性光學成像，探討了乙醇對DNA光學特性的影響。有助于進一步理解生物組織中DNA二次諧波效應的產生機制及其影響因素，對進一步獲取生物組織DNA的細微結構信息，拓寬其在生物醫(yī)學領域的應用具有一定的指導意義和參考價值。,,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究背景和內容,實驗原理、流程和裝置,DNA樣品的SHG成像結果,討論,總結和展望,不足與展望：（1）乙醇對DNA二次諧波成像的影響只是做了定性的研究，未來還可以考慮定量方面的研究。（2）還可以考慮其它的化學試劑（如十二烷基硫酸鈉：SDS，乙二胺四乙酸二鈉鹽：EDTA等）對DNA非線性光學特性產生影響，并進行相關的研究。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,致謝,本論文是在導師金鷹老師的細心指導和幫助下完成的。在此，我向金鷹老師表示衷心的感謝，感謝他三年來在我的科研、學習和生活上的指導、關心與幫助！感謝鄧小元老師的幫助與支持，感謝光子中醫(yī)實驗室的其他各位老師對我學習和研究上很多有益的幫助和鼓勵。感謝光子中醫(yī)實驗室的各位同學在我的實驗相關工作中的關心與幫助。感謝國家自然科學基金項目/科學部主任基金項目（30940020）對本課題的資助和支持！感謝我的父母及家人在我三年碩士期間對我的長期支持與鼓勵！最后，衷心地感謝各位答辯老師能夠在百忙之中參與我的答辯?。?腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究生期間發(fā)表的論文,1、羅冬梅、金鷹等，“腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像”《光譜學與光譜分析》，2012；2、羅冬梅，金鷹等，“人類基因組非冗余Exon/Intron數據庫的構建”《華南師范大學學報》，2010；3、羅冬梅，金鷹等，“腫瘤基因組研究進展”《激光生物學報》，2009。,ThankYou!,