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瓊脂糖凝膠電泳Agarosegelelectrophoresis,天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉是從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。,瓊脂糖（agarose）半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷,D-半乳糖,核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段,1.因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲2.對蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象。3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來分離酶的復合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。4.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測定6.樣品易回收，常用于制備。,瓊脂糖凝膠電泳的優(yōu)點,缺點1.機械強度差，易破碎，濃度不能太低。2.易被細菌污染，不易保存，臨用前配制。3.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴散，電泳后必須立即固定染色。4.與PAGE相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。,一、實驗目的掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法,DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。,DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。,二、實驗原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定。,瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。,溴化乙錠（EthidiumBromide,EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復合物，其熒光強度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品DNA濃度。,三、實驗材料、器具及藥品質(zhì)粒DNA樣品。電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測儀等。瓊脂糖，1XTBE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），6X載樣緩沖液,四、實驗步驟⑴1g瓊脂糖加入100ml1TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并搖勻。）,⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固。,⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。,⑷用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔。,⑸打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，電泳約30min-60min。,⑺將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。,⑹將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。,,,123M,1、DNA分子的大小雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)近似成反比；2、瓊脂糖濃度濃度越低，相同核酸分子遷移越快；3、DNA的構(gòu)象同一分子：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞切口環(huán)狀,DNA的遷移速率決定因素,4、凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負電荷減少、剛性和長度增加。5、所用的電壓低電壓時DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。6、瓊脂糖種類常見的有兩種：標準瓊脂糖和低熔點瓊脂糖；,不同類型瓊脂糖的性質(zhì),不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍,常用的電泳緩沖液,4℃保存?zhèn)溆?,7、電泳緩沖液,TAE和TBE電泳緩沖液比較,都是常用電泳緩沖液，二者相比：1）TAE的緩沖容量較低，如長時間電泳會被消耗，此時凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2）TBE比TAE花費稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE中遷移快10%；4）對于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，對于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。,凝膠載樣緩沖液,載樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個作用：1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；3）其中的染料在電場中以可以預測的泳動速率向陽極遷移。,6凝膠載樣緩沖液,瓊脂糖凝膠中DNA的檢測,通過染色,紫外燈下檢測。主要采用溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）染色法。,使用EB染色注意事項,（1）EB被認為是一種強致癌物質(zhì)（2）EB可用來檢測單鏈或雙鏈核酸（3）EB使用時的配制、貯存及使用EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5μg/ml。（4）當要知道DNA片段準確大小時，凝膠應在無EB情況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色。,凝膠中DNA的成像,可以用透射或入射紫外光對EB染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計算機觀察。,關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳的實驗技巧和方法\幾點注意事項,1）加樣時槍頭不要碰壞凝膠壁，否則DNA的帶型將不會整齊，加樣前要用槍頭吸打凝膠孔中的溶液，以趕走樣品空中的氣泡。2）每孔最大DNA上樣量決定于DNA樣品片段的大小、數(shù)目及樣品孔形狀與容量。3）應注意每孔最大上樣容量及樣品孔體積，以免加樣時樣品流入附近樣品孔造成交叉污染，影響結(jié)果分析。4）在實驗加樣中不一定每一個樣品都換一個槍頭，可在陽極槽中反復吸打電泳緩沖液以清洗。（對于Southern印跡轉(zhuǎn)移和需要回收DNA片段的電泳，則應該每一個樣品用一個槍頭加樣，避免樣品交叉污染。）,5）凝膠中加入EB進行電泳，便于紫外線下觀察電泳狀態(tài)，但EB會導致線形DNA遷移率下降，這在酶切質(zhì)粒與空白對照質(zhì)粒一起電泳時應值得注意。6）電泳過程中，溴化乙錠向負極移動，與DNA泳動的方向相反，較長時間的電泳會造成靠正極方向的凝膠中溴化乙錠含量低，會對含量較少的小分子DNA片段檢測困難。處理方法是：將凝膠在0.5ug/ml的EB溶液中染色30－45分鐘。7）判斷正負極的另一方法是負極氣泡（H2）比正極氣泡（O2）多一倍。,