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第35講　基因工程 [考綱要求]　1.基因工程的誕生(A)。2.基因工程的原理及技術(shù)(含PCR技術(shù))(B)。3.基因工程的應用(B)。4.蛋白質(zhì)工程(A)。5.轉(zhuǎn)基因生物的安全性問題(A)。6.生物武器對人類的威脅(A)。 考點一　基因工程的操作工具 1．基因工程的概念 (1)供體：提供目的基因。 (2)操作環(huán)境：體外。 (3)操作水平：分子水平。 (4)原理：基因重組。 (5)受體：表達目的基因。 (6)本質(zhì)：性狀在受體體內(nèi)的表達。 (7)優(yōu)點：克服遠緣雜交不親和的障礙，定向改造生物的遺傳性狀。 2．基因工程的工具 (1)限制性核酸內(nèi)切酶(簡稱：限制酶) ①來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。 ②作用：識別特定的脫氧核苷酸序列并切開特定部位的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。 ③結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平口末端。 (2)DNA連接酶 ①作用：將限制酶切割下來的DNA片段拼接成DNA分子。 ②DNA連接酶和限制酶的關(guān)系 歸納提升　與DNA相關(guān)的五種酶的比較 名稱 作用部位 作用結(jié)果 限制酶 磷酸二酯鍵 將DNA切成兩個片段 DNA連接酶 磷酸二酯鍵 將兩個DNA片段連接為一個DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯鍵 將單個脫氧核糖核苷酸依次連接到單鏈末端 DNA (水解)酶 磷酸二酯鍵 將DNA片段水解為單個脫氧核糖核苷酸 解旋酶 堿基對之間的氫鍵 將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈 (3)載體 ①種類：質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。 ②質(zhì)粒的特點 深化拓展　載體上標記基因的作用 載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內(nèi)表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細胞，原理如下圖所示： 1．有關(guān)工具酶的判斷 (1)限制酶只能用于切割目的基因(　　) (2)切割質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶均能特異性地識別6個核苷酸序列(　　) (3)DNA連接酶能將兩堿基間通過氫鍵連接起來(　　) (4)EcoliDNA連接酶既可連接平口末端，又可連接黏性末端(　　) (5)限制酶也可以識別和切割RNA(　　) (6)限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具酶(　　) 2．有關(guān)載體的判斷 (1)載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因(　　) (2)每個質(zhì)粒DNA分子上至少含一個限制酶識別位點(　√　) (3)質(zhì)粒是小型環(huán)狀DNA分子，是基因工程常用的載體(　√　) (4)載體的作用是將攜帶的目的基因?qū)胧荏w細胞中，使之穩(wěn)定存在并表達(　√　) (5)外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動子和終止子之間才能進行復制(　　) 下圖中的圖1和圖2分別表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意圖，據(jù)圖分析： (1)請說出EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶識別的堿基序列及切割的位點。 提示　EcoRⅠ限制酶識別的堿基序列是GAATTC，切割位點在G和A之間；SmaⅠ限制酶識別的堿基序列是CCCGGG，切割位點在C和G之間。 (2)以上實例說明限制酶有何特性？ 提示　說明限制酶具有專一性(特異性)。 命題點一　工具酶的應用分析 1．(2018北京，5)用XhoⅠ和SalⅠ兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別處理同一DNA片段，酶切位點及酶切產(chǎn)物分離結(jié)果如圖。以下敘述不正確的是(　　) A．圖1中兩種酶識別的核苷酸序列不同 B．圖2中酶切產(chǎn)物可用于構(gòu)建重組DNA C．泳道①中是用SalⅠ處理得到的酶切產(chǎn)物 D．圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA 答案　D 解析　通過圖1可知，兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子的不同部位，說明兩種限制性核酸內(nèi)切酶識別的核苷酸序列不同，A正確；圖2中的酶切產(chǎn)物是DNA分子片段，可用于構(gòu)建重組DNA，B正確；觀察圖1可知，該DNA片段有3個SalⅠ酶切位點，故用SalⅠ處理后，可形成4個DNA分子片段，電泳后出現(xiàn)4條電泳帶，C正確；限制性核酸內(nèi)切酶作用的是雙鏈DNA片段，因此圖中被酶切的DNA片段應是雙鏈DNA，D錯誤。 2．用限制酶EcoRⅤ單獨切割某普通質(zhì)粒，可產(chǎn)生14kb(1kb即1000個堿基對)的長鏈，而同時用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ聯(lián)合切割該質(zhì)粒，可得到三種長度的DNA片段，見下圖(其中*表示EcoRⅤ限制酶切割后的一個黏性末端)。 若用MboⅠ限制酶單獨切割該普通質(zhì)粒，則產(chǎn)生的DNA片段的長度為(　　) A．2.5和5.5 B．2.5和6 C．5.5和8 D．6和8 答案　D 解析　依圖示可知，該質(zhì)粒上有1個EcoRⅤ限制酶的切點、2個MboⅠ限制酶的切點，故用限制酶MboⅠ單獨切割該質(zhì)粒時，將產(chǎn)生長度為6和8的兩種片段。 3．(2016全國Ⅲ，40)圖(a)中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列與切割位點，圖(b)為某種表達載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。 根據(jù)基因工程的有關(guān)知識，回答下列問題： (1)經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被________酶切后的產(chǎn)物連接，理由是______________________________________。 (2)若某人利用圖(b)所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖(c)所示。這三種重組子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產(chǎn)物的有________，不能表達的原因是____________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有______________和______________，其中既能連接黏性末端又能連接平口末端的是__________________。 答案　(1)Sau3AⅠ　兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲、丙　甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄　(3)EcoliDNA連接酶　T4DNA連接酶　T4DNA連接酶 解析　(1)分析圖(a)可知，限制酶Sau3AⅠ與BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，故經(jīng)這兩種酶切割得到的產(chǎn)物可以用DNA連接酶進行連接。(2)構(gòu)建基因表達載體時，為保證目的基因能在宿主細胞中成功表達，目的基因應插入在啟動子和終止子之間，據(jù)此可判斷甲、丙均不符合要求，目的基因均不能表達。(3)常見的DNA連接酶有Ecoli DNA連接酶和T4 DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平口末端。 科學思維　限制酶的選擇方法 根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類。 (1)應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。 (2)不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。 (3)為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點)。 命題點二　載體的應用分析 4．(2019南京高三一模)質(zhì)粒是細菌中的有機分子，下列對其描述，不正確的是(多選)(　　) A．質(zhì)粒完全水解后最多可產(chǎn)生4種化合物 B．質(zhì)粒能夠自主復制 C．質(zhì)粒中含有兩個游離的磷酸基團 D．質(zhì)粒是基因工程的工具酶 答案　ACD 解析　質(zhì)粒是一種具有自主復制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子，不含游離的磷酸基團，完全水解后最多可產(chǎn)生6種化合物：脫氧核糖、磷酸、4種含氮堿基，A、C錯誤，B正確；質(zhì)粒是基因工程的載體，不是工具酶，D錯誤。 5．(2016全國Ⅰ，40)某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}： (1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有____________________________(答出兩點即可)，而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。 (2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是_______________________________________ ____________________________________________； 并且________________和____________________________________的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有________的固體培養(yǎng)基。 (3)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自于________________________________________________________________________。 答案　(1)能自我復制、具有標記基因　(2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長　含有質(zhì)粒載體　含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或含有重組質(zhì)粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長　四環(huán)素　(3)受體細胞 解析　(1)質(zhì)粒作為載體應具備的基本條件有：能自我復制、具有標記基因、含有一個至多個限制酶切割位點等。(2)由題意可知，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞中均不含有氨芐青霉素抗性基因，所以在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上均不能生長。質(zhì)粒載體上含有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，插入了目的基因的重組質(zhì)粒中僅含有氨芐青霉素抗性基因，所以含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的細胞均能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，但前者可以在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長而后者不能，所以可用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基，篩選出含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落。(3)噬菌體屬于病毒，病毒增殖過程中所需的原料、酶等均來自于受體細胞。 考點二　基因工程的操作過程與蛋白質(zhì)工程 1．基因工程的基本操作過程 (1)獲取目的基因 ①目的基因：主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。 ②獲取目的基因的方法 a．直接分離法：從自然界已有的物種中分離，如從基因組文庫或部分基因文庫中獲取。 b．人工合成：如果基因比較小，脫氧核苷酸序列又已知，可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。 ③擴增目的基因：通過PCR技術(shù)擴增目的基因。 (2)構(gòu)建基因表達載體——基因工程的核心 ①目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。 ②基因表達載體的組成 小貼士　啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子 (1)啟動子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶識別、結(jié)合的部位。 (2)終止子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，位于基因的尾端。作用是使轉(zhuǎn)錄過程停止。 (3)起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。 ③構(gòu)建過程 (3)將目的基因?qū)胧荏w細胞 生物種類 植物 動物 微生物 常用方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射法 感受態(tài)細胞法 受體細胞 體細胞或受精卵 受精卵 原核細胞 轉(zhuǎn)化過程 將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T—DNA上→農(nóng)桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞染色體的DNA上→表達 將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子 (4)檢測和鑒定目的基因 2．基因工程的應用 (1)植物基因工程：培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物、抗病轉(zhuǎn)基因植物和抗逆轉(zhuǎn)基因植物；利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)和利用植物生產(chǎn)藥物。 (2)動物基因工程：用于提高動物生長速度從而提高產(chǎn)品產(chǎn)量；用于改善畜產(chǎn)品品質(zhì)；用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物；用轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體等。 (3)比較基因治療與基因診斷 項目 原理 操作過程 進展 基因 治療 基因表達 利用正?；?qū)胗谢蛉毕莸募毎?，以表達出正常性狀來治療(疾病) 臨床 實驗 基因 診斷 堿基互補 配對 制作特定DNA探針與病人樣品DNA混合，分析雜交帶情況 臨床 應用 3.蛋白質(zhì)工程 (1)流程圖 A．轉(zhuǎn)錄，B.翻譯，C.分子設(shè)計，D.多肽鏈，E.預期功能。 (2)結(jié)果：改造了現(xiàn)有蛋白質(zhì)或制造出新的蛋白質(zhì)。 (3)應用：主要集中應用于對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，改良生物性狀。 1．有關(guān)基因工程原理與操作的判斷 (1)設(shè)計擴增目的基因的引物時不必考慮表達載體的序列(　　) (2)用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列(　√　) (3)為培育抗除草劑的作物新品種，導入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體(　　) (4)抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體上也未必能正常表達(　√　) (5)檢測目的基因是否成功表達可用抗原—抗體雜交技術(shù)(　√　) (6)應用DNA分子雜交法，可以檢測轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達(　　) 2．有關(guān)基因工程的應用及蛋白質(zhì)工程的判斷 (1)將人的干擾素基因重組到質(zhì)粒后導入大腸桿菌，可獲得能產(chǎn)生人干擾素的菌株(　√　) (2)利用乳腺生物反應器能夠獲得一些重要的醫(yī)藥產(chǎn)品，如人的血清白蛋白，這是因為將人的血清白蛋白基因?qū)肓藙游锏娜橄偌毎?　　) (3)由大腸桿菌工程菌獲得人的干擾素后可直接應用(　　) (4)蛋白質(zhì)工程的目的是改造或合成人類需要的蛋白質(zhì)(　√　) (5)蛋白質(zhì)工程是在分子水平上對蛋白質(zhì)分子直接進行操作，定向改變分子的結(jié)構(gòu)(　　) 據(jù)圖分析抗蟲棉的培育過程 (1)該基因工程中的目的基因和載體分別是什么？一般情況下，為什么要用同一種限制酶處理目的基因和載體？ 提示　目的基因是Bt毒蛋白基因，載體是Ti質(zhì)粒。用同一種限制酶處理目的基因和載體，可以獲得相同的黏性末端，便于構(gòu)建基因表達載體。 (2)該實例中，采用何種方法導入目的基因？為什么目的基因可以整合到染色體的DNA上？ 提示　采用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，由于Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移到受體細胞且能整合到受體細胞的染色體DNA上，而目的基因又插入到了T－DNA上，所以目的基因可以整合到受體細胞染色體的DNA上。 (3)該實例中，檢測目的基因是否成功表達的常見方法有哪兩種？ 提示　抗原—抗體雜交法、用棉葉飼喂棉鈴蟲。 1．基因組文庫與cDNA文庫(部分基因文庫)的比較 文庫類型 部分基因文庫 基因組文庫 構(gòu)建基因文庫的過程 某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA 　　↓逆轉(zhuǎn)錄 cDNA 與載體↓連接導入 　受體菌群體　 某種生物體內(nèi)全部DNA ↓限制酶 　許多DNA片段 分別與載體↓連接導入 受體菌群體 文庫大小 小 大 基因中 啟動子 無 有 基因中 內(nèi)含子 無 有 基因多少 某種生物的部分基因 某種生物的全部基因 物種間的 基因交流 可以 部分基因可以 說明 基因文庫的組建過程就包含基因工程的基本操作步驟。從基因文庫中獲取目的基因的優(yōu)點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性 2.通過PCR技術(shù)擴增目的基因 (1)PCR的含義：是一項在生物體外通過酶促反應有選擇地大量擴增目的基因或DNA序列的技術(shù)。 (2)目的：短時間內(nèi)大量擴增目的基因。 (3)原理：DNA分子半保留復制。 (4)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。 (5)過程 ①加入反應物質(zhì)：在離心管中加入所需要的模板DNA、引物、4種脫氧核苷酸以及TaqDNA聚合酶。 ②變性：加熱至94℃左右，使DNA中的氫鍵斷裂，雙鏈解開。 ③退火(復性)：冷卻到55℃左右，引物與單鏈DNA相應互補序列結(jié)合。 ④延伸：加熱至72℃左右，在TaqDNA聚合酶的作用下，沿模板延伸子鏈，最終合成2條DNA分子。 3．蛋白質(zhì)工程與基因工程的比較 (1)區(qū)別 項目 蛋白質(zhì)工程 基因工程 過程 預期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計預期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核糖核苷酸序列 獲取目的基因→基因表達載體的構(gòu)建→將目的基因?qū)胧荏w細胞→目的基因的檢測和鑒定 實質(zhì) 定向改造或生產(chǎn)人類所需的蛋白質(zhì) 定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型和生物產(chǎn)品 結(jié)果 可生產(chǎn)自然界沒有的蛋白質(zhì) 只能生產(chǎn)自然界已有的蛋白質(zhì) (2)聯(lián)系 ①蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程。 ②基因工程中所利用的某些酶需要通過蛋白質(zhì)工程進行修飾、改造。 命題點一　基因工程操作程序的分析 1．(2018全國Ⅰ，38)回答下列問題： (1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達。該研究除證明了質(zhì)?？梢宰鳛檩d體外，還證明了________________________ ________________________________________________________________________________ _____________________________________________________(答出兩點即可)。 (2)體外重組的質(zhì)?？赏ㄟ^Ca2＋參與的________方法導入大腸桿菌細胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與________組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導入宿主細胞。在細菌、心肌細胞、葉肉細胞中，可作為重組噬菌體宿主細胞的是________。 (3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細胞內(nèi)表達時，表達出的蛋白質(zhì)可能會被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解，在實驗中應選用____________的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應添加________的抑制劑。 答案　(1)體外重組的質(zhì)粒可以進入受體細胞；真核生物基因可在原核細胞中表達　(2)轉(zhuǎn)化　外殼蛋白(或噬菌體蛋白)　細菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶 解析　(1)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導入大腸桿菌中，該過程利用的技術(shù)是基因工程。該研究除了證明質(zhì)?？勺鳛檩d體外，還證明了體外重組的質(zhì)粒可以進入受體細胞，真核生物基因可在原核細胞中表達等。(2)重組質(zhì)粒導入大腸桿菌細胞可采用Ca2＋參與的轉(zhuǎn)化方法；體外重組噬菌體要通過將體外重組的噬菌體DNA和外殼蛋白(或噬菌體蛋白)進行組裝獲得；因為噬菌體是專門寄生在細菌中的病毒，所以宿主細胞選用細菌。(3)為防止蛋白質(zhì)被降解，在實驗中應選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞；在蛋白質(zhì)純化過程中，為防止目的蛋白質(zhì)被降解，需要添加蛋白酶的抑制劑。 2．(2018海南，31)甜蛋白是一種高甜度的特殊蛋白質(zhì)。為了改善黃瓜的品質(zhì)，科學家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將一種甜蛋白基因成功導入黃瓜細胞，得到了轉(zhuǎn)基因植株?；卮鹣铝袉栴}： (1)用農(nóng)桿菌感染時，應優(yōu)先選用黃瓜________(填“受傷的”或“完好的”)葉片與含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，選用這種葉片的理由是___________________________________________ _______________________________________。 (2)若在轉(zhuǎn)基因黃瓜中檢測到這種甜蛋白，則表明該重組質(zhì)粒中______________已轉(zhuǎn)移到植物細胞中且能夠表達；用該轉(zhuǎn)基因黃瓜的某一植株與一株非轉(zhuǎn)基因植株雜交，發(fā)現(xiàn)子代中含甜蛋白個體數(shù)與不含甜蛋白個體數(shù)之比為1∶1，則說明甜蛋白基因已經(jīng)整合到____________(填“核基因組”“線粒體基因組”或“葉綠體基因組”)中。 (3)假設(shè)某種轉(zhuǎn)基因作物因為受到病毒感染而減產(chǎn)，若要以該轉(zhuǎn)基因作物為材料獲得脫毒苗，應選用__________作為外植體進行組織培養(yǎng)。 (4)通常，基因工程操作主要有4個步驟，即目的基因獲取、重組表達載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細胞、目的基因的檢測與鑒定。因此，基因工程的含義可概括為 ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)受傷的　葉片傷口處的細胞釋放出大量酚類物質(zhì)，可吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞　 (2)甜蛋白基因　核基因組　(3)莖尖　(4)按照人們的愿望進行設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出符合人們需要的新生物類型 解析　(1)用農(nóng)桿菌感染時，應優(yōu)先選用黃瓜受傷的葉片與含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，理由是葉片傷口處的細胞會釋放出大量酚類物質(zhì)，可吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞。 (2)若在轉(zhuǎn)基因黃瓜中檢測到這種甜蛋白，則表明該重組質(zhì)粒中甜蛋白基因已轉(zhuǎn)移到植物細胞中且能夠表達；用該轉(zhuǎn)基因黃瓜的某一植株與一株非轉(zhuǎn)基因植株雜交，發(fā)現(xiàn)子代中含甜蛋白個體數(shù)與不含甜蛋白個體數(shù)之比為1∶1，則說明甜蛋白基因已經(jīng)整合到核基因組中。(3)假設(shè)某種轉(zhuǎn)基因作物因為受到病毒感染而減產(chǎn)，若要以該轉(zhuǎn)基因作物為材料獲得脫毒苗，應選用莖尖作為外植體進行組織培養(yǎng)。(4)通常，基因工程操作主要有4個步驟，即目的基因獲取、重組表達載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細胞、目的基因的檢測與鑒定。因此，基因工程的含義可概括為按照人們的愿望進行設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出符合人們需要的新生物類型。 命題點二　基因工程與蛋白質(zhì)的關(guān)系的分析 3．(2018天津，31)甲型流感病毒為RNA病毒，易引起流感大規(guī)模流行。我國科學家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環(huán)節(jié)如下。 (1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成對應DNA后，利用________技術(shù)擴增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達時不能合成完整長度的________，因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原等其他基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒，并保存。 (2)構(gòu)建適合改造病毒增殖的轉(zhuǎn)基因宿主細胞。設(shè)計合成一種特殊tRNA的基因，其產(chǎn)物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結(jié)合，并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與________連接后導入宿主細胞。提取宿主細胞的________進行分子雜交鑒定，篩選獲得成功表達上述tRNA的轉(zhuǎn)基因宿主細胞。 (3)利用轉(zhuǎn)基因宿主細胞制備疫苗。將(1)中的重組質(zhì)粒導入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細胞，并在補加______________的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，則該宿主細胞能利用上述特殊tRNA，翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，產(chǎn)生大量子代病毒，用于制備疫苗。特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄時，識別其啟動子的酶是________(單選)。 A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶 C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶 (4)上述子代病毒不能在正常宿主細胞中增殖，沒有致病性，因此不經(jīng)滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比，該病毒活疫苗的優(yōu)勢之一是可引起____________免疫，增強免疫保護效果。 答案　(1)PCR　多肽(或蛋白質(zhì))　(2)載體　總RNA　(3)非天然氨基酸(Uaa)　D　(4)細胞 解析　(1)體外進行DNA擴增采用的技術(shù)手段是多聚酶鏈式反應(PCR技術(shù))。將基因內(nèi)個別編碼氨基酸的序列改造成編碼終止密碼子的序列后，在翻譯時終止密碼子提前出現(xiàn)，不能合成完整長度的多肽(或蛋白質(zhì))。(2)為了使目的基因能夠在受體細胞中穩(wěn)定存在并正常表達，需要將目的基因與載體連接后導入受體細胞。利用分子雜交技術(shù)鑒定，篩選獲得成功表達目的RNA的細胞時，需提取宿主細胞的總RNA。(3)將(1)中的重組質(zhì)粒導入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細胞，宿主細胞內(nèi)由于沒有Uaa，翻譯將會在終止密碼子處停止，將不能翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻譯出完整蛋白，需要在培養(yǎng)基中加入Uaa。轉(zhuǎn)錄時，識別啟動子的酶為RNA聚合酶，因為轉(zhuǎn)錄在宿主細胞中進行，所以轉(zhuǎn)錄用的酶為宿主細胞的RNA聚合酶。(4)不具有侵染性的滅活病毒不能進入人體細胞內(nèi)，只會引發(fā)體液免疫，而減毒的活疫苗雖然不能在人體細胞內(nèi)正常增殖，但可以侵入人體細胞，能引起人體產(chǎn)生細胞免疫，增強免疫保護效果。 4．(2019馬鞍山二中模擬)胰島素可以用于治療糖尿病，但是胰島素被注射到人體后，會堆積在皮下，并且要經(jīng)過較長時間才能進入血液中，而進入血液的胰島素又容易被分解，因此，治療效果受到影響。如圖是用蛋白質(zhì)工程設(shè)計速效胰島素的生產(chǎn)過程，請據(jù)圖回答有關(guān)問題： (1)構(gòu)建新的蛋白質(zhì)模型是蛋白質(zhì)工程的關(guān)鍵，圖中構(gòu)建新的胰島素模型的主要依據(jù)是________________________________________________________________________。 (2)人工合成的DNA與________結(jié)合后，被導入到______________________中才能得以表達。 (3)若要利用大腸桿菌生產(chǎn)速效胰島素，需用到的生物工程有____________、____________和發(fā)酵工程。 (4)圖解中從新的胰島素模型到新的胰島素基因的基本思路是什么？ ________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________。 答案　(1)蛋白質(zhì)的預期功能　(2)載體　大腸桿菌等受體細胞　(3)蛋白質(zhì)工程　基因工程　(4)根據(jù)新的胰島素中氨基酸的序列，推測出其脫氧核苷酸序列，然后利用DNA合成儀來合成出新的胰島素基因 解析　(1)蛋白質(zhì)工程的目標是根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行分子設(shè)計。因此，圖中構(gòu)建新的胰島素模型的依據(jù)是預期胰島素，即速效胰島素的功能。(2)人工合成的目的基因與載體結(jié)合后，被導入受體細胞中才能得以表達。(3)利用蛋白質(zhì)工程生產(chǎn)自然界中原本不存在的蛋白質(zhì)，需對原有的胰島素進行改造，根據(jù)新的胰島素中氨基酸的序列推測出其基因中的脫氧核苷酸序列，人工合成新的胰島素基因即目的基因，改造好的目的基因需通過基因工程將其導入受體細胞獲得工程菌，再利用工程菌進行發(fā)酵，從而獲取大量產(chǎn)品，因此該過程涉及蛋白質(zhì)工程、基因工程和發(fā)酵工程。(4)由新的蛋白質(zhì)模型到構(gòu)建新的基因，其基本設(shè)計思路是根據(jù)新的蛋白質(zhì)中的氨基酸序列，推測出其基因中的脫氧核苷酸序列，然后利用DNA合成儀直接合成新的基因。 考點三　轉(zhuǎn)基因生物的安全性與生物武器 1．轉(zhuǎn)基因生物的安全性 (1)轉(zhuǎn)基因植物的安全性 ①食用安全問題。 ②對生態(tài)系統(tǒng)的影響 a．轉(zhuǎn)基因植物的擴散對生物多樣性有無影響。 b．導入的目的基因是否會擴散漂移到其他物種體內(nèi)而導致自然界的混亂。 c．若大面積種植轉(zhuǎn)基因植物，其殘體分解物、根部分泌物等是否會對生態(tài)與環(huán)境造成大規(guī)模的負面效應等。 (2)轉(zhuǎn)基因動物的安全性 ①對人體健康的影響。 ②對生態(tài)系統(tǒng)的影響。 (3)轉(zhuǎn)基因生物安全性的保障措施 ①保障公眾對所購食品是否來源于轉(zhuǎn)基因生物擁有知情權(quán)。 ②國家應建立相應的評估及預警機制。 2．生物武器的危害性 (1)所用微生物種類 ①細菌：霍亂弧菌、炭疽桿菌等。 ②病毒：埃博拉病毒、天花病毒等。 (2)被用作生物武器的方法 ①將致病基因插入不致病的微生物體內(nèi)。 ②將抗普通疫苗或藥物的基因插入致病細菌或病毒中。 ③用于研制針對某一特定種群的生物武器。 (1)國際上大多數(shù)國家都在轉(zhuǎn)基因食品標簽上警示性注明可能的危害(　　) (2)轉(zhuǎn)入油菜的抗除草劑基因，可能通過花粉傳入環(huán)境中(　√　) (3)目前對轉(zhuǎn)基因生物安全性的爭論主要集中在食用安全性和環(huán)境安全性上(　√　) (4)轉(zhuǎn)基因作物被動物食用后，目的基因會轉(zhuǎn)入動物體細胞中(　　) (5)種植轉(zhuǎn)基因植物有可能因基因擴散影響野生植物的遺傳多樣性(　√　) (6)中國反對生物武器，但中國在特殊情況下可以生產(chǎn)生物武器(　　) 自1984年第一例轉(zhuǎn)基因魚在我國誕生以來，轉(zhuǎn)基因魚的研究取得很大進步。如轉(zhuǎn)入外源生長激素(GH)基因的魚生長速度快，餌料轉(zhuǎn)化率高，但魚類易于逃逸、擴散，因此轉(zhuǎn)基因魚的生態(tài)安全性問題是很值得研究的問題，需研究轉(zhuǎn)基因魚對生態(tài)系統(tǒng)的壓力及外源基因的擴散問題。最近，我國科學家只是將三倍體的轉(zhuǎn)基因魚投入自然系統(tǒng)。 (1)轉(zhuǎn)基因魚培育成功的物質(zhì)基礎(chǔ)是什么？ 提示　遺傳物質(zhì)都是DNA。 (2)魚類易于逃逸、擴散，因此轉(zhuǎn)基因魚的生態(tài)安全性問題是很值得研究的問題，試分析引起生態(tài)安全性問題的原因。 提示　轉(zhuǎn)基因魚與同種野生魚雜交，使野生魚帶有轉(zhuǎn)基因，具有生長優(yōu)勢，使其捕食對象大量減少，與其他物種競爭加劇，引起生態(tài)危機。 (3)多倍體魚類對控制過度繁殖是有效的，科學家培育成功三倍體“湘云鯽”，說出其形成過程。 提示　轉(zhuǎn)基因的二倍體個體加倍為四倍體轉(zhuǎn)基因個體，然后二倍體與四倍體雜交形成三倍體。 (4)試從保障生態(tài)安全性問題分析只投放三倍體魚的原因。 提示　三倍體魚不能繁殖，可以人工控制養(yǎng)殖數(shù)量和范圍，避免發(fā)生雜交、競爭，引起生態(tài)危機。 命題點一　生物技術(shù)的安全性問題分析 1．轉(zhuǎn)基因生物的安全性引起人們爭論的技術(shù)原因是(　　) ①轉(zhuǎn)移基因的功能往往未知 ②轉(zhuǎn)移基因的結(jié)構(gòu)往往未知 ③外源基因插入宿主基因組的部位往往是隨機的 ④外源基因往往是異種生物的基因 A．①② B．②③ C．③④ D．①③ 答案　C 解析　由于科學水平的限制，目前科學家對基因的結(jié)構(gòu)、基因間的相互作用以及基因的調(diào)控機制了解有限；轉(zhuǎn)移的基因雖然功能已知，但不少是異種生物的基因；外源基因插入宿主基因組的部位往往是隨機的。因此，在轉(zhuǎn)基因生物中，有時候會出現(xiàn)意想不到的后果，引起人們在食物安全、生物安全和環(huán)境安全三個方面的激烈爭論。 2．基因工程產(chǎn)物可能存在著一些安全性問題，但不必擔心的是(　　) A．四倍體轉(zhuǎn)基因鯉魚與正常鯉魚的雜交，導致自然種群被淘汰 B．載體的標記基因(如抗生素抗性基因)可能指導合成有利于抗性進化的產(chǎn)物 C．目的基因(如殺蟲基因)本身編碼的產(chǎn)物可能會對人體產(chǎn)生毒性 D．目的基因通過花粉的散布轉(zhuǎn)移到其他植物體內(nèi)，從而可能打破生態(tài)平衡 答案　A 解析　四倍體轉(zhuǎn)基因鯉魚與正常鯉魚雜交，后代個體的體細胞中含三個染色體組，在減數(shù)分裂過程中聯(lián)會發(fā)生紊亂，因此不能產(chǎn)生后代，不會導致自然種群被淘汰；標記基因和目的基因可能含有抗性基因和毒性基因，均存在一定的安全性問題；基因散布到其他植物體內(nèi)，也有可能改變其特性導致生態(tài)環(huán)境的平衡遭到破壞。 歸納提升　(1)轉(zhuǎn)基因生物存在安全性問題的原因 ①目前對基因的結(jié)構(gòu)、調(diào)控機制及基因間的相互作用了解有限。 ②目的基因往往是異種生物的基因。 ③外源基因插入宿主基因組的部位往往是隨機的。 ④轉(zhuǎn)基因生物具有較強的生長優(yōu)勢，其他物種競爭力弱而大量死亡，引起生態(tài)危機。 (2)安全性常見誤區(qū) ①引入外來物種≠增加生物多樣性：如果引進的生物會破壞環(huán)境或者對當?shù)厣锏纳嬖斐捎绊?，可能會造成生物多樣性的銳減。 ②轉(zhuǎn)基因生物具有危害≠阻止技術(shù)的發(fā)展：應用正確態(tài)度對待轉(zhuǎn)基因技術(shù)，不能因為可能的危害而阻止技術(shù)的發(fā)展。 命題點二　生物武器的危害分析 3．生物武器的危害有傳染性強的特點，針對這一特點，下列哪項不是防治生物武器的有效措施(　　) A．提前接種和個人的防護 B．發(fā)現(xiàn)病人，立即報告，及時隔離 C．注意切斷傳播途徑 D．只注意環(huán)境消毒，不注意動植物滅菌 答案　D 解析　防治生物武器，既要注意環(huán)境消毒，又要注意動植物滅菌，因為動植物也可以成為傳染源。 4．(2019宿遷質(zhì)檢)若轉(zhuǎn)基因技術(shù)被濫用，恐怖組織就會將它用于恐怖行為，下列不屬于恐怖行為的是(　　) A．把蠟狀桿菌通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造成像炭疽桿菌一樣的致病菌 B．把炭疽桿菌基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)重組到人體內(nèi)，使人具有免疫力 C．把流感病毒基因改造，只會使具有某種易感基因的人群感染，而其他人卻不易感染 D．將生物毒素分子的基因與流感病毒的基因拼接在一起 答案　B 解析　經(jīng)過基因重組獲得的致病菌屬于生物武器的一種，A項錯誤；炭疽桿菌是一種讓感染者死亡率極高的致病菌，使人具有該病菌的免疫力不是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的濫用，不屬于恐怖行為，B項正確；把流感病毒基因改造，只會使具有某種易感基因的人群感染，屬于恐怖行為，C項錯誤；將生物毒素分子的基因與流感病毒的基因拼接在一起，屬于恐怖行為，D項錯誤。 矯正易錯　強記長句 1．限制酶是一類酶，而不是一種酶。 2．將一個基因從DNA分子上切割下來，需要切兩處，同時產(chǎn)生四個黏性末端或平口末端。 3．不同DNA分子用同一種限制酶切割，產(chǎn)生的末端都相同，同一個DNA分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的末端一般不相同。 4．限制酶切割位點應位于標記基因之外，不能破壞標記基因，以便進行檢測。 5．目的基因的插入位點不是隨意的：基因表達需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因的插入位點應在啟動子與終止子之間。 6．受體細胞選擇時需注意：要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素必須用真核生物酵母菌(需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌)；一般不用支原體，原因是它營寄生生活；一定不能用哺乳動物成熟的紅細胞，原因是它無細胞核，不能合成蛋白質(zhì)。 7．轉(zhuǎn)基因生物具有危害≠阻止技術(shù)的發(fā)展：應用正確的態(tài)度對待轉(zhuǎn)基因技術(shù)，不能因為可能的危害而阻止技術(shù)的發(fā)展。 1.限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識別特定的脫氧核苷酸序列，并在特定的位點上切割DNA分子。DNA連接酶的作用部位是磷酸二酯鍵。 2．質(zhì)粒是常用的載體，它是一種小型的雙鏈環(huán)狀DNA分子，具有一個至多個限制酶切割位點及標記基因。 3．基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因和復制原點。 4．培育轉(zhuǎn)基因動物時，受體細胞必須是受精卵；培育轉(zhuǎn)基因植物時，受體細胞可以是受精卵，也可以是體細胞。 5．目的基因?qū)胫参锛毎Ｓ棉r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；導入動物細胞常用顯微注射法，導入微生物細胞常用感受態(tài)細胞法。 6．目的基因到了另一種生物體內(nèi)能夠成功表達的原理是所有生物共用一套遺傳密碼。 重溫高考　演練模擬 1．(2014江蘇，23)下列關(guān)于基因工程技術(shù)的敘述，錯誤的是(多選)(　　) A．切割質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶均特異性地識別6個核苷酸序列 B．PCR反應中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應 C．載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因 D．抗蟲基因即使成功地插入到植物細胞染色體上也未必能正常表達 答案　ABC 解析　A項，限制性核酸內(nèi)切酶大多特異性地識別6個核苷酸序列，但也有少數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶能識別4個、5個或8個核苷酸序列。B項，PCR反應中溫度周期性變化是為變性、復性和延伸創(chuàng)造條件。另外，耐高溫的DNA聚合酶只是在延伸階段發(fā)揮催化作用，變性和復性過程不需要酶的催化。C項，載體質(zhì)粒上的抗生素抗性基因可作為標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇，而不是抗生素合成基因。D項，目的基因?qū)胧荏w細胞后不一定能正常表達。 2．(2018江蘇，32)為生產(chǎn)具有特定性能的α淀粉酶，研究人員從某種海洋細菌中克隆了α淀粉酶基因(1656個堿基對)，利用基因工程大量制備α淀粉酶，實驗流程見下圖。請回答下列問題： (1)利用PCR技術(shù)擴增α淀粉酶基因前，需先獲得細菌的________________。 (2)為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的________端加上限制性酶切位點，且常在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是_________________________ ________________________________________________________________________。 (3)進行擴增時，反應的溫度和時間需根據(jù)具體情況進行設(shè)定，下列選項中________的設(shè)定與引物有關(guān)，________的設(shè)定與擴增片段的長度有關(guān)。(填序號) ①變性溫度?、谕嘶饻囟取、垩由鞙囟取、茏冃詴r間　⑤退火時間　⑥延伸時間 (4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α淀粉酶的mRNA的部分堿基序列： 圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含________個密碼子，如虛線框后的序列未知，預測虛線框后的第一個密碼子最多有________種。 (5)獲得工程菌表達的α淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測定酶活性，結(jié)果如下： 緩沖液 50mmol/L Na2HPO4KH2PO4 50mmol/L TrisHCl 50mmol/L GlyNaOH pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5 酶相對活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8 根據(jù)上述實驗結(jié)果，初步判斷該α淀粉酶活性最高的條件為____________________________。 答案　(1)基因組DNA　(2)5′　使DNA片段能定向插入表達載體，減少自連　(3)②　⑥　(4)8　13　(5)pH為8.5，緩沖液為50mmol/LTrisHCl 解析　(1)利用PCR技術(shù)擴增α淀粉酶基因前，需先獲得細菌的基因組DNA作為模板，并依據(jù)α淀粉酶基因兩端的部分核苷酸序列合成兩條引物。(2)利用PCR技術(shù)擴增DNA時，只能從3′端延伸DNA子鏈，為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的5′端加上限制性酶切位點，并且要注意在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點，這樣既能防止目的基因、載體的自身連接，又能確保目的基因與表達載體的定向連接。(3)PCR技術(shù)包括變性、退火(復性)和延伸三步，變性溫度決定PCR反應中雙鏈DNA的解鏈，且時間很短；退火時引物結(jié)合到互補的DNA單鏈上，退火溫度由引物復性溫度決定，其溫度設(shè)定與引物的長度、堿基組成及濃度等有關(guān)；延伸時間與產(chǎn)物片段的長度有關(guān)。(4)圖中虛線框內(nèi)共含有24個堿基，mRNA上3個相鄰的堿基編碼1個氨基酸，故共包含8個密碼子。虛線框后的第1個密碼子的第1個堿基是U，第2和第3個堿基各有4種可能性，因此共有16種可能性。題干表明控制α淀粉酶的基因有1656個堿基對，說明圖中虛線框后的第一個密碼子肯定不是終止密碼子(3種終止密碼子為UAA、UAG、UGA)，故虛線框后第一個密碼子實際最多有16－3＝13種可能性。(5)分析表格中的數(shù)據(jù)，酶相對活性最高為99.5%，對應的條件是pH為8.5，緩沖液為50mmol/LTrisHCl。 3．(2016江蘇，33)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中標注了相關(guān)限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復標注。請回答下列問題： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ 識別序 列及切 割位點 ↓　　　 GGATCC CCTAGG 　↑ ↓　　　 TGATCA ACTAGT 　↑ ↓　　　 GATC CTAG 　↑ ↓　　　 AAGCTT TTCGAA 　↑ (1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應選用________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于________態(tài)的大腸桿菌。 (2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中___________________________________。 (3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為__________________________，對于該部位，這兩種酶________(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。 (4)若用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。 答案　(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA連接　感受　(2)四環(huán)素　引物甲和引物丙　(3)　都不能　(4)7 解析　(1)選擇的限制酶應在目的基因兩端存在識別位點，且至少有一個標記基因，BamHⅠ會破壞兩個標記基因，因此只能選BclⅠ和HindⅢ。酶切后的載體和目的基因片段，通過DNA連接酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于感受態(tài)的大腸桿菌。(2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，根據(jù)質(zhì)粒上的抗性基因，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素。PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，沿相反的方向合成子鏈。(3)根據(jù)BamHⅠ和BclⅠ的酶切位點，BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為，與兩種酶的酶切位點均不同。(4)根據(jù)BamHⅠ、BclⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點，Sau3AⅠ在質(zhì)粒上有三個酶切位點，完全酶切可得到記為A、B、C三種片段，若部分位點被切開，可得到AB、AC、BC、ABC四種片段，所以用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。 一、選擇題 1．(2018淮陰高三三模)應用基因工程技術(shù)將抗蟲基因A和抗除草劑基因B成功導入植株W(2n＝40)的染色體組中。植株W自交，子代中既不抗蟲也不抗除草劑的植株所占比例為1/16。取植株W某部位的一個細胞放在適宜條件下培養(yǎng)，產(chǎn)生4個子細胞。用熒光分子檢測基因A和基因B(基因A、基因B均能被熒光標記)。下列敘述正確的是(　　) A．植株W獲得抗蟲和抗除草劑變異性狀，其原理是染色體變異 B．若4個子細胞都只含有一個熒光點，則子細胞中的染色體數(shù)是40 C．若有的子細胞不含熒光點，則細胞分裂過程中發(fā)生過基因重組 D．若4個子細胞都含有兩個熒光點，則細胞分裂過程中出現(xiàn)過20個四分體 答案　C 解析　題中應用基因工程技術(shù)將兩種目的基因?qū)胫参锛毎湓硎腔蛑亟M，A錯誤；若4個子細胞都只含有一個熒光點，說明子細胞只含有基因A或基因B中的一個，進而說明其進行的是減數(shù)分裂，則子細胞中的染色體數(shù)目是20條，B錯誤；若有的子細胞不含熒光點，說明細胞進行的是減數(shù)分裂，減數(shù)分裂過程中會發(fā)生基因重組，C正確；若4個子細胞都含有兩個熒光點，說明細胞進行的是有絲分裂，而有絲分裂過程中不會出現(xiàn)四分體，D錯誤。 2．(2019揚州高三上學期模擬)目前，歐洲、亞洲許多國家都發(fā)現(xiàn)了禽流感疫情，并引起了人體感染，造成多人死亡?？茖W工作者經(jīng)研究，發(fā)現(xiàn)了數(shù)種快速檢驗禽流感病原體的方法，以正確診斷禽流感。下列與禽流感病原體研究、診斷有關(guān)的說法中錯誤的是(　　) A．鏡檢法：在光學顯微鏡下直接觀察病人的痰液或血液，以發(fā)現(xiàn)病原體 B．PCR技術(shù)：體外基因復制技術(shù)，可在幾十分鐘內(nèi)把病原體的基因擴增到數(shù)百萬倍 C．抗原—抗體法：用特殊制備的病原體蛋白質(zhì)與病人血清中的相關(guān)抗體特異性結(jié)合，發(fā)現(xiàn)病原體 D．DNA探針技術(shù)：用放射性同位素、熒光因子等標記的DNA分子做探針，利用DNA分子雜交原理來檢測病原體 答案　A 解析　病毒在光學顯微鏡下無法看到，只有在電子顯微鏡下才能觀察到，A錯誤；PCR用于體外快速擴增特定基因或DNA序列，B正確；病原體進入人體后會刺激機體產(chǎn)生特異性免疫反應，產(chǎn)生相應抗體，由于抗體與抗原結(jié)合具有特異性，因此用特殊制備的病原體蛋白質(zhì)與病人血清中的相關(guān)抗體特異性結(jié)合，可發(fā)現(xiàn)病原體，C正確；可以利用DNA分子作為探針，通過DNA分子雜交技術(shù)檢測病原體，D正確。 3．如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性核酸內(nèi)切酶。下列說法錯誤的是(　　) A．圖示過程是基因工程的核心步驟 B．表達載體構(gòu)建時需要用到限制酶SmaⅠ C．抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來 D．除圖示組成外，表達載體中還應該含有啟動子和終止子等結(jié)構(gòu) 答案　B 解析　圖示過程為基因表達載體的構(gòu)建過程，是基因工程中的核心步驟，A正確；構(gòu)建過程中需要將目的基因完整切割下來，此時要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，B錯誤；抗卡那霉素基因是標記基因，目的是便于鑒定和篩選含有目的基因的細胞，C正確；基因表達載體包括啟動子、目的基因、終止子和標記基因等，D正確。 4．(2018天津和平區(qū)高三第一次質(zhì)量調(diào)查)基因疫苗由病毒核酸的一段無毒序列制成，由編碼能引起保護性免疫反應的病原體抗原的基因片段和載體構(gòu)建而成。以下敘述錯誤的是(　　) A．被導入細胞后，能與宿主染色體整合 B．接種后若感染此病原微生物，則體內(nèi)記憶細胞會產(chǎn)生大量抗體 C．基因疫苗引起免疫反應前必須經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程 D．將疫苗基因轉(zhuǎn)移到植物細胞中，可以生產(chǎn)可食用的疫苗 答案　B 解析　病毒感染宿主細胞后，其基因可以高效地整合到宿主染色體中，因此外源基因可以在宿主細胞內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地表達，A正確；接種疫苗后人體產(chǎn)生針對該病原體的特異性免疫，若感染此病原微生物，則體內(nèi)記憶細胞會迅速增殖分化成漿細胞，漿細胞會產(chǎn)生大量抗體，B錯誤；疫苗中的病毒基因片段能編碼引起保護性免疫反應的病原體抗原，其化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以基因疫苗引起免疫反應前必須經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程，C正確；將疫苗基因轉(zhuǎn)移到水果和西紅柿等植物細胞中，可生產(chǎn)可食用疫苗，D正確。 5．2018年1月30日，加拿大食品檢驗局批準了第三