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2019-2020年高三生物一輪復(fù)習(xí)精講精練 第35講 基因工程（一） 蘇教版 1．涵蓋范圍 本單元包括選修3全部?jī)?nèi)容——基因工程、細(xì)胞工程、胚胎工程以及生態(tài)工程。 2．考情分析 (1)考查力度：占分比重相對(duì)穩(wěn)定，如山東理綜只出一個(gè)8分的簡(jiǎn)答題。 (2)考查內(nèi)容 ①基因工程中三種工具。 ②基因工程操作四步曲。 ③基因工程成果——轉(zhuǎn)基因生物實(shí)例及安全性討論。 ④細(xì)胞工程中植物組織培養(yǎng)、植物體細(xì)胞雜交。 ⑤動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和單克隆抗體的制備及應(yīng)用。 ⑥核移植技術(shù)。 ⑦胚胎工程中胚胎移植和胚胎分割。 ⑧干細(xì)胞的研究。 (3)考查形式 ①有的省將選修與必修有機(jī)結(jié)合，既可出簡(jiǎn)答題也可出選擇題。 ②有的省如山東省全部以簡(jiǎn)答題形式呈現(xiàn)，且不與必修聯(lián)系。 3．復(fù)習(xí)指導(dǎo) (1)復(fù)習(xí)線索 ①以基因工程的具體成果(如抗蟲棉)為主線，系統(tǒng)復(fù)習(xí)基因工程的操作工具和操作步驟等知識(shí)點(diǎn)。 ②以植物的組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)，系統(tǒng)復(fù)習(xí)其他細(xì)胞工程技術(shù)手段。 ③以體內(nèi)受精作用和個(gè)體發(fā)育過(guò)程為基礎(chǔ)，系統(tǒng)復(fù)習(xí)胚胎工程的流程。 (2)復(fù)習(xí)方法 ①圖解法復(fù)習(xí)基因工程和胚胎工程。 ②比較法復(fù)習(xí)植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)；植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合及單克隆抗體制備。 ③關(guān)注熱點(diǎn)科研成果，注意知識(shí)的實(shí)踐應(yīng)用。 第35講　基因工程(一) [考綱要求]　1.基因工程的誕生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技術(shù)(Ⅱ)。 考點(diǎn)一　聚焦基因工程的概念及基本工具 1．分析基因工程的概念 (1)供體：提供目的基因。 (2)操作環(huán)境：體外。 (3)操作水平：分子水平。 (4)原理：基因重組。 (5)受體：表達(dá)目的基因。 (6)本質(zhì)：性狀在受體體內(nèi)表達(dá)。 (7)優(yōu)點(diǎn)：克服遠(yuǎn)源雜交不親和的障礙，定向改造生物的遺傳性狀。 2．基因工程的基本工具(判一判) (1)限制性核酸內(nèi)切酶只能用于切割目的基因 (　　) (2)限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子具有特異性 (　√　) (3)限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子后可產(chǎn)生黏性末端和平口末端兩種類型 (　√　) (4)DNA連接酶能將兩堿基間通過(guò)形成氫鍵連接起來(lái) (　　) (5)Ecoli DNA連接酶既可連接平口末端，又可連接黏性末端 (　　) (6)質(zhì)粒是小型環(huán)狀DNA分子，是基因工程常用的載體 (　√　) (7)載體的作用是攜帶目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中，使之穩(wěn)定存在并表達(dá) (　√　) 易錯(cuò)警示　巧辨基因工程操作工具易錯(cuò)點(diǎn) (1)限制性核酸內(nèi)切酶是一類酶，而不是一種酶。 (2)限制性核酸內(nèi)切酶的成分為蛋白質(zhì)，其作用的發(fā)揮需要適宜的理化條件，高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿均易使之變性失活。 (3)在切割目的基因和載體時(shí)要求用同一種限制性核酸內(nèi)切酶，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。 (4)將一個(gè)基因從DNA分子上切割下來(lái)，需要切兩處，同時(shí)產(chǎn)生4個(gè)黏性末端。 (5)不同DNA分子用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的黏性末端都相同，同一個(gè)DNA分子用不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。 (6)限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)應(yīng)位于標(biāo)記基因之外，不能破壞標(biāo)記基因，以便于進(jìn)行檢測(cè)。 (7)基因工程中的載體與細(xì)胞膜上物質(zhì)運(yùn)輸?shù)妮d體不同。基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)；膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。 (8)基因工程中有3種工具，但工具酶只有2種。 1. 如圖所示為部分雙鏈DNA片段，下列有關(guān)基因工程中工具 酶功能的敘述錯(cuò)誤的是 (　　) A．切斷a處的酶為限制性核酸內(nèi)切酶 B．連接a處的酶為DNA連接酶 C．切斷b處的酶為DNA解旋酶 D．連接b處的酶為RNA聚合酶 答案　D 解析　限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子，通常形成黏性末端，即能切割DNA鏈外側(cè)的磷酸二酯鍵(圖中的a處)，內(nèi)側(cè)堿基對(duì)之間的氫鍵(b處)可通過(guò)DNA解旋酶水解。DNA連接酶將切斷的磷酸二酯鍵進(jìn)行連接，即圖中的a處。RNA聚合酶的作用是催化DNA的轉(zhuǎn)錄。 2．限制性核酸內(nèi)切酶MunⅠ和限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)分別是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如圖表示四種質(zhì)粒和目的基因，其中，箭頭所指部位為限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，質(zhì)粒的陰影部分表示標(biāo)記基因。適于作為圖示目的基因載體的質(zhì)粒是 (　　) 答案　A 解析　由圖可知，質(zhì)粒B上無(wú)標(biāo)記基因，不適合作為載體；質(zhì)粒C和D的標(biāo)記基因上都有限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)；只有質(zhì)粒A上既有標(biāo)記基因，且Mun Ⅰ的切割位點(diǎn)不在標(biāo)記基因上。 1．與DNA有關(guān)的酶 (1)五種相關(guān)酶的比較 作用底物 作用部位 形成產(chǎn)物 限制性核 酸內(nèi)切酶 DNA分子 磷酸二酯鍵 黏性末端或平口末端 DNA連接酶 DNA片段 磷酸二酯鍵 重組DNA分子 DNA聚合酶 脫氧核苷酸 磷酸二酯鍵 子代DNA DNA解旋酶 DNA分子 堿基對(duì)間的氫鍵 形成脫氧核苷酸單鏈 DNA(水解)酶 DNA分子 磷酸二酯鍵 游離的脫氧核苷酸 (2)限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶之間的關(guān)系圖示 2．對(duì)載體的分析 條　件 目　的 穩(wěn)定并能復(fù)制 目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)大 有一個(gè)至多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn) 可攜帶多個(gè)或多種外源基因 具有特殊的標(biāo)記基因 便于重組DNA的鑒定和選擇 考點(diǎn)二　基因工程的操作步驟 觀察基因工程的操作過(guò)程，分析每一步驟的操作程序 易錯(cuò)警示　基因工程操作易錯(cuò)點(diǎn) (1)目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的：基因表達(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入到啟動(dòng)子與終止子之間的部位。(2)基因工程操作過(guò)程中只有第三步(將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞)沒(méi)有堿基互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象：第一步存在逆轉(zhuǎn)錄法獲得DNA，第二步存在黏性末端連接現(xiàn)象，第四步檢測(cè)存在分子水平雜交方法。(3)原核生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。(4)一般情況下，用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的片段，但有時(shí)可用兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，這樣可避免質(zhì)粒和質(zhì)粒之間、目的基因和目的基因之間的連接。(5)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)是目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。(6)不熟悉標(biāo)記基因的種類和作用：標(biāo)記基因的作用——篩選、檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，常見(jiàn)的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達(dá)產(chǎn)物為帶顏色的物質(zhì))等。(7)對(duì)受體細(xì)胞模糊不清：受體細(xì)胞常用植物受精卵或體細(xì)胞(經(jīng)組織培養(yǎng))、動(dòng)物受精卵(一般不用體細(xì)胞)、微生物(大腸桿菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必須用真核生物酵母菌(需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌)；一般不用支原體，原因是它營(yíng)寄生生活；一定不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，原因是它無(wú)細(xì)胞核，不能合成蛋白質(zhì)。(8)還應(yīng)注意的問(wèn)題有：①基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子(DNA片段)≠起始密碼子(RNA)；終止子(DNA片段)≠終止密碼子(RNA)。②基因表達(dá)載體的構(gòu)建是最核心、最關(guān)鍵的一步，在體外進(jìn)行。 3．下列有關(guān)基因工程操作的敘述中，正確的是 (　　) A．用同種限制性核酸內(nèi)切酶切割載體與目的基因可獲得相同的黏性末端 B．以蛋白質(zhì)的氨基酸序列為依據(jù)合成的目的基因與原基因的堿基序列相同 C．檢測(cè)到受體細(xì)胞含有目的基因就標(biāo)志著基因工程操作的成功 D．用含抗生素抗性基因的質(zhì)粒作為載體是因?yàn)槠淇剐曰虮阌谂c外源基因連接 答案　A 解析　一種氨基酸可以由多種密碼子控制，因此以蛋白質(zhì)的氨基酸序列為依據(jù)合成的目的基因與原基因通常不同；只有目的基因表達(dá)，使受體表現(xiàn)出目標(biāo)性狀或獲得目標(biāo)產(chǎn)物才標(biāo)志著基因工程操作的成功；抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因，用于檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。 4．浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院喻景權(quán)教授課題組研究發(fā)現(xiàn)，一種植物激素——油菜素內(nèi)酯能促進(jìn)農(nóng)藥在植物體內(nèi)的降解和代謝。用油菜素內(nèi)酯處理后，許多參與農(nóng)藥降解的基因(如P450基因和紅霉素抗性基因)的表達(dá)和酶活性都得到提高，在這些基因“指導(dǎo)”下合成的蛋白酶能把農(nóng)藥逐漸轉(zhuǎn)化為水溶性物質(zhì)或低毒甚至無(wú)毒物質(zhì)，有的則被直接排出體外。某課題組進(jìn)一步進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn)操作，請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)獲得油菜素內(nèi)酯合成酶基因的方法有____________________________________。步驟①用PCR技術(shù)擴(kuò)增基因時(shí)用到的耐高溫酶通常是指______________________________；步驟②用到的酶有______________________________________________________。 (2)圖中導(dǎo)入重組質(zhì)粒的方法是____________，在導(dǎo)入之前應(yīng)用一定濃度的__________________處理受體細(xì)菌。 (3)導(dǎo)入重組質(zhì)粒2以后，往往還需要進(jìn)行檢測(cè)和篩選，可用____________制成探針，檢測(cè)是否導(dǎo)入了重組基因，在培養(yǎng)基中加入________可將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。 (4)請(qǐng)你為該課題命名：____________________________________________________。 答案　(1)從基因組文庫(kù)中獲取、人工合成目的基因或PCR合成(任選其中兩項(xiàng)即可)　Taq DNA聚合酶　限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶　(2)轉(zhuǎn)化法　氯化鈣溶液　(3)紅霉素抗性基因　紅霉素　(4)探究油菜素內(nèi)酯能否促進(jìn)土壤中農(nóng)藥的分解 解析　進(jìn)行基因工程操作時(shí)，首先要獲取目的基因，其方法有多種：從基因組文庫(kù)中獲取、人工合成目的基因或PCR合成等。在構(gòu)建基因表達(dá)載體的過(guò)程中，用到的工具酶有限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。圖中的受體細(xì)胞是細(xì)菌，故用轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入基因表達(dá)載體，導(dǎo)入后，需檢驗(yàn)和篩選。從圖中可以看出，最終是通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因細(xì)菌對(duì)土壤中殘留農(nóng)藥的分解能力。 1．獲得目的基因 (1)如果目的基因的序列是已知的，可用化學(xué)方法合成目的基因，或者用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增目的基因。 (2)如果目的基因的核苷酸序列是未知的，可以從基因文庫(kù)中獲取。 2．制備重組DNA分子 (1)重組DNA分子的結(jié)構(gòu)：?jiǎn)?dòng)子、目的基因、終止子以及標(biāo)記基因等。 (2)重組DNA分子的制備方法： 3．轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 生物種類 植物 動(dòng)物 微生物 常用方法 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù) 顯微注射技術(shù) 感受態(tài)細(xì)胞法 受體細(xì)胞 體細(xì)胞 受精卵 原核細(xì)胞 轉(zhuǎn)化過(guò)程 將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的TDNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的DNA上→表達(dá) 將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物 Ca2＋處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子 4．篩選重組細(xì)胞 (1)篩選的原因：不是所有的受體細(xì)胞接納了重組DNA分子，只有部分受體細(xì)胞中含有目的基因。 (2)篩選的方法：插入滅活法。 5．實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)：培育受體細(xì)胞并誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。 6．實(shí)例：抗軟化番茄的培育過(guò)程 (1)目的基因：抗多聚半乳糖醛酸酶基因 (2)受體細(xì)胞：番茄體細(xì)胞 (3)轉(zhuǎn)化方法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù) (4)轉(zhuǎn)化過(guò)程：抗多聚半乳糖醛酸酶基因與農(nóng)桿菌質(zhì)粒結(jié)合形成重組質(zhì)粒→重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌→用農(nóng)桿菌侵染普通番茄細(xì)胞→利用植物組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)導(dǎo)入目的基因成功的番茄體細(xì)胞→含有抗多聚半乳糖醛酸酶基因的抗軟化番茄。 1．(xx浙江卷，6)將ada(腺苷酸脫氨酶基因)通過(guò)質(zhì)粒pET28b導(dǎo)入大腸桿菌并成功表達(dá)腺苷酸脫氨酶。下列敘述錯(cuò)誤的是 (　　) A．每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞至少含一個(gè)重組質(zhì)粒 B．每個(gè)重組質(zhì)粒至少含一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn) C．每個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)至少插入一個(gè)ada D．每個(gè)插入的ada至少表達(dá)一個(gè)腺苷酸脫氨酶分子 答案　C 解析　大腸桿菌成功表達(dá)出腺苷酸脫氨酶，說(shuō)明這些大腸桿菌都至少含一個(gè)重組質(zhì)粒，A項(xiàng)正確；作為載體的條件為至少含一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)，所以作為載體的質(zhì)粒至少含一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，B項(xiàng)正確；作為基因表達(dá)載體應(yīng)包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因四部分，但并不是每個(gè)酶切位點(diǎn)都至少插入一個(gè)ada，C項(xiàng)錯(cuò)誤；由于這些目的基因成功表達(dá)，所以每個(gè)ada至少表達(dá)一個(gè)腺苷酸脫氨酶分子，D項(xiàng)正確。 2．(xx新課標(biāo)全國(guó)卷，40)根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí)，回答下列問(wèn)題： (1)限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子后產(chǎn)生的片段，其末端類型有____________ 和____________。 (2)質(zhì)粒載體用EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的片段如下： AATTC……G 　　　　　　G……CTTAA 為使載體與目的基因相連，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，還可用另一種限制性核酸內(nèi)切酶切割，該酶必須具有的特點(diǎn)是________________________________ ________________________________________。 (3)按其來(lái)源不同，基因工程中所使用的DNA連接酶有兩類，即__________DNA連接酶和__________DNA連接酶。 (4)反轉(zhuǎn)錄作用的模板是______________，產(chǎn)物是______________。若要在體外獲得大量 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，常采用____________技術(shù)。 (5)基因工程中除質(zhì)粒外，____________和____________也可作為載體。 (6)若用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，一般情況下，不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，原因是_________________________________________________________。 答案　(1)黏性末端　平口末端　(2)切割產(chǎn)生的DNA片段末端與EcoRⅠ切割產(chǎn)生的末端相同(其他合理答案也可)　(3)Ecoli　T4　(4)mRNA(或RNA)　cDNA(或DNA)　PCR　(5)噬菌體　動(dòng)植物病毒(其他合理答案也可)　(6)未處理的大腸桿菌吸收質(zhì)粒(外源DNA)的能力極弱(其他合理答案也可) 解析　(1)DNA分子經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有黏性末端和平口末端兩種類型。(2)為使載體與目的基因相連，應(yīng)使二者被切割后產(chǎn)生的末端相同，故用另一種限制性核酸內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的末端必須與EcoRⅠ切割產(chǎn)生的末端相同。(3)根據(jù)酶的來(lái)源不同，DNA連接酶分為EcoliDNA連接酶和T4DNA連接酶。(4)mRNA(或RNA)為模板，合成DNA的過(guò)程稱為逆轉(zhuǎn)錄，若要體外獲得大量DNA分子，可以使用RCR技術(shù)。(5)在基因工程中，通常利用質(zhì)粒作為載體，另外噬菌體和動(dòng)植物病毒也可作為載體。(6)大腸桿菌作為受體細(xì)胞時(shí)，常用Ca2＋處理，使之成為能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)細(xì)胞。 3．(xx江蘇卷，32)圖1表示含有目的基因D的DNA片段長(zhǎng)度(bp即堿基對(duì))和部分堿基序列，圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列?，F(xiàn)有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4種限制性核酸內(nèi)切酶，它們識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。 請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)圖1的一條脫氧核苷酸鏈中相鄰兩個(gè)堿基之間依次由________________________ ____________連接。 (2)若用限制性核酸內(nèi)切酶SmaⅠ完全切割圖1中DNA片段，產(chǎn)生的末端是 ____________末端，其產(chǎn)物長(zhǎng)度為_(kāi)_____________。 (3)若圖1中虛線方框內(nèi)的堿基對(duì)被T－A堿基對(duì)替換，那么基因D就突變?yōu)榛騞。從雜合子中分離出圖1及其對(duì)應(yīng)的DNA片段，用限制性核酸內(nèi)切酶SmaⅠ完全切割，產(chǎn)物中共有____________種不同長(zhǎng)度的DNA片段。 (4)若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過(guò)同種限制性核酸內(nèi)切酶處理后進(jìn)行連接，形成重組質(zhì)粒，那么應(yīng)選用的限制性核酸內(nèi)切酶是____________。在導(dǎo)入重組質(zhì)粒后，為了篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，一般需要用添加____________的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)檢測(cè)，部分含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達(dá)，其最可能的原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)脫氧核糖、磷酸、脫氧核糖　(2)平口　537 bp、790 bp、661 bp　(3)4　(4)BamH Ⅰ　抗生素B　同種限制性核酸內(nèi)切酶切割形成的末端相同，部分目的基因D與質(zhì)粒反向連接 解析　(1)一條脫氧核苷酸鏈中相鄰的兩個(gè)堿基之間是通過(guò)“—脫氧核糖—磷酸—脫氧核糖—”相連的，要注意兩條脫氧核苷酸鏈的相鄰堿基之間通過(guò)氫鍵相連進(jìn)行區(qū)分。(2)從SmaⅠ的識(shí)別序列和切點(diǎn)可見(jiàn)，其切割后產(chǎn)生的是平口末端，圖1中DNA片段有Sma Ⅰ的兩個(gè)識(shí)別序列，故切割后產(chǎn)生的產(chǎn)物長(zhǎng)度為537(534＋3)bp、790(796－3－3)bp和661(658＋3)bp三種。(3)圖示方框內(nèi)發(fā)生堿基對(duì)的替換后，形成的d基因失去了1個(gè)Sma Ⅰ的識(shí)別序列，故D基因、d基因用Sma Ⅰ完全切割后產(chǎn)物中除原有的3種長(zhǎng)度的DNA片段外，還增加一種537＋790 bp的DNA片段。(4)目的基因的兩端都有BamH Ⅰ的識(shí)別序列，質(zhì)粒的啟動(dòng)子后的抗生素A抗性基因上也有BamH Ⅰ的識(shí)別序列，故應(yīng)選用的限制性核酸內(nèi)切酶是BamH Ⅰ，此時(shí)抗生素B抗性基因作為標(biāo)記基因，故篩選時(shí)培養(yǎng)基中要添加抗生素B。若重組質(zhì)粒已導(dǎo)入了受體細(xì)胞卻不能表達(dá)，很可能是因?yàn)橛猛N限制性核酸內(nèi)切酶切割后，目的基因和質(zhì)粒有兩種連接方式，導(dǎo)入受體細(xì)胞的重組質(zhì)粒是目的基因和質(zhì)粒反向連接形成的。 1．下列一般不作為基因工程中的標(biāo)記基因的是 (　　) A．四環(huán)素抗性基因 B．綠色熒光蛋白基因 C．產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因 D．貯藏蛋白的基因 答案　D 解析　標(biāo)記基因位于載體(質(zhì)粒)上，以利于重組DNA的鑒定和選擇，如四環(huán)素抗性基因、綠色熒光蛋白基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。 2．若要利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構(gòu)建重組DNA(圖丙)，限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)分別是BglⅡ(AGATCT)、EcoRⅠ(GAATTC)和Sau3AⅠ(GATC)。下列分析合理的是 (　　) A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體 B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體 C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體 D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體 答案　D 解析　解答本題的關(guān)鍵是要看準(zhǔn)切割后目的基因插入的方向，只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體，構(gòu)建的重組DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移動(dòng)方向才一定與圖丙相同。 3．質(zhì)粒作為“分子運(yùn)輸車”的條件是 (　　) ①能夠自我復(fù)制?、陔p鏈環(huán)狀DNA分子?、塾卸鄠€(gè)限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)?、苡袠?biāo)記基因?、菡婧思?xì)胞中沒(méi)有 A．①②③④⑤ B．①②③④ C．①③④ D．②③⑤ 答案　C 解析　載體具備的條件是：能自我復(fù)制；有標(biāo)記基因；最好有多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)；能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在并大量復(fù)制。 4．下列關(guān)于基因表達(dá)載體構(gòu)建的相關(guān)敘述，不正確的是 (　　) A．需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶 B．必須在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行 C．抗生素抗性基因可作為標(biāo)記基因 D．啟動(dòng)子位于目的基因的首端 答案　B 解析　基因表達(dá)載體是目的基因與載體的結(jié)合，在此過(guò)程中需用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因與載體，用DNA連接酶將相同的末端連接起來(lái)；基因表達(dá)載體的構(gòu)建是在細(xì)胞外進(jìn)行的；基因表達(dá)載體包括啟動(dòng)子(位于基因首端使轉(zhuǎn)錄開(kāi)始)、終止子、目的基因和標(biāo)記基因。 5．下面是獲得抗蟲棉的技術(shù)流程示意圖。有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是 (　　) A．重組質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程中需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶 B．圖中愈傷組織分化產(chǎn)生的再生植株基因型一般都相同 C．卡那霉素抗性基因中含有相關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn) D．轉(zhuǎn)基因抗蟲棉有性生殖的后代不能穩(wěn)定保持抗蟲性狀 答案　C 解析　卡那霉素抗性基因是標(biāo)記基因，在構(gòu)建目的基因的表達(dá)載體時(shí)，不能被限制性核酸內(nèi)切酶破壞，不應(yīng)有相關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。愈傷組織分化產(chǎn)生再生植株是通過(guò)有絲分裂來(lái)實(shí)現(xiàn)的，再生植株的基因型一般都相同。通過(guò)土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因?qū)朊藁?xì)胞后，在有性生殖過(guò)程中，目的基因不一定能通過(guò)生殖細(xì)胞傳給子代，故不能穩(wěn)定保持抗蟲性狀。 6．如圖是從酵母菌中獲取某植物需要的某種酶的基因的流程，結(jié)合所學(xué)知識(shí)及相關(guān)信息回答下列問(wèn)題： (1)圖中cDNA文庫(kù)____基因組文庫(kù)(大于、等于、小于)。 (2)①過(guò)程提取的DNA需要____________________的切割，B過(guò)程是____________過(guò)程。 (3)為在短時(shí)間內(nèi)大量獲得目的基因，可用的技術(shù)是____________，其原理是________________________________________________________________________。 (4)目的基因獲取之后，需要進(jìn)行____________________，其組成必須有____________________________及標(biāo)記基因等，此步驟是基因工程的核心。 (5)將該目的基因?qū)肽畴p子葉植物細(xì)胞，常采用的方法是__________________，其能否在此植物體內(nèi)穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是____________________________________。 答案　(1)小于　(2)限制性核酸內(nèi)切酶　逆轉(zhuǎn)錄　(3)PCR技術(shù)　DNA復(fù)制　(4)制備重組DNA分子　啟動(dòng)子、終止子、目的基因(復(fù)制原點(diǎn)可不答)　(5)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)　目的基因是否整合到植物細(xì)胞的染色體上 解析　(1)基因組文庫(kù)是指將某生物的全部基因組DNA切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段克隆到某種載體上形成的集合；cDNA文庫(kù)是由mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的基因組成的，由于基因的選擇性表達(dá)，cDNA文庫(kù)小于基因組文庫(kù)。(2)從供體細(xì)胞的DNA中獲取目的基因，首先應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶將目的基因從其所在的DNA分子上切割下來(lái)；B過(guò)程是以mRNA為模板合成DNA的過(guò)程，應(yīng)為逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。(3)PCR技術(shù)是一種體外擴(kuò)增DNA的方法，其原理為DNA復(fù)制，能將得到的目的基因在細(xì)胞外大量擴(kuò)增。(4)制備重組DNA分子包括目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子和終止子，其構(gòu)建是基因工程的核心。(5)將目的基因?qū)肽畴p子葉植物細(xì)胞常采用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，目的基因只有整合到植物細(xì)胞的染色體上才能在植物體內(nèi)穩(wěn)定遺傳。 7．科學(xué)家將人的生長(zhǎng)激素基因與pBR322質(zhì)粒進(jìn)行重組，得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入牛的受精卵，使其發(fā)育為轉(zhuǎn)基因牛，再通過(guò)細(xì)胞工程培育為轉(zhuǎn)基因克隆牛。pBR322質(zhì)粒含有兩個(gè)抗生素抗性基因和5個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶切點(diǎn)(如圖2)。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，并成功地在大腸桿菌中得以表達(dá)。請(qǐng)據(jù)圖回答： (1)圖1中顯示的人的生長(zhǎng)激素基因是通過(guò)人工合成的，圖中①過(guò)程需要的酶是____________。該過(guò)程所依據(jù)的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則是________________________(用字母和箭頭表示)。 (2)圖1中的mRNA是從人體的哪種細(xì)胞中獲取的？ ________________________________________________________________________。 (3)重組質(zhì)粒形成與否需要鑒定和篩選，方法是將重組質(zhì)粒的DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌，通過(guò)含抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察大腸桿菌的生長(zhǎng)、繁殖情況進(jìn)行判斷，如圖3所示： ①如果受體菌在培養(yǎng)基A上能生長(zhǎng)、繁殖形成菌落，而不能在培養(yǎng)基B上生長(zhǎng)、繁殖，則使用限制性核酸內(nèi)切酶a的切點(diǎn)是圖2中的__________________________________ _____________，即目的基因插入了__________________中。 ②如果受體菌在培養(yǎng)基A上不能生長(zhǎng)、繁殖形成菌落，而在培養(yǎng)基B上能生長(zhǎng)、繁殖，則使用限制性核酸內(nèi)切酶a的切點(diǎn)是圖2中的____________，即目的基因插入了________________中。 ③如果受體菌在培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B上都能生長(zhǎng)、繁殖形成菌落，則使用限制性核酸內(nèi)切酶a的切點(diǎn)是圖2中的________。 答案　(1)逆轉(zhuǎn)錄酶　A→T、U→A、G→C、C→G　(2)垂體細(xì)胞　(3)①切點(diǎn)3或切點(diǎn)4或切點(diǎn)5　抗四環(huán)素基因 ②切點(diǎn)1　抗氨芐青霉素基因　③切點(diǎn)2 解析　(1)以mRNA為模板合成DNA的過(guò)程中需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化，遵循A→T、U→A、G→C、C→G的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。(2)題中所用的目的基因?yàn)槿说纳L(zhǎng)激素基因，生長(zhǎng)激素是由垂體細(xì)胞分泌的，因此，只有在垂體細(xì)胞中才能獲得相應(yīng)的mRNA。(3)結(jié)合質(zhì)粒中標(biāo)記基因的類型，以及目的基因插入的位置即可判斷限制性核酸內(nèi)切酶a的切點(diǎn)。