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第35講　基因工程 [考綱明細(xì)]　1.基因工程的誕生(Ⅰ)　2.基因工程的原理及技術(shù)(含PCR技術(shù))(Ⅱ)　3.基因工程的應(yīng)用(Ⅱ)　4.蛋白質(zhì)工程(Ⅰ)　實驗：DNA的粗提取與鑒定 知識自主梳理 一、基因工程的概念及基本工具 1．基因工程概念 2．DNA重組技術(shù)的基本工具 (1)限制性核酸內(nèi)切酶(簡稱：限制酶) ①來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。 ②作用：識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。 ③結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端。 例：如下圖所示，EcoRⅠ限制酶識別的堿基序列是—GAATTC—，切割位點在G和A之間；SmaⅠ限制酶識別的堿基序列是—CCCGGG—，切割位點在C和G之間；說明限制酶具有特異性。 ④本質(zhì)：蛋白質(zhì)。 [深入思考]　限制酶為何不切割自身DNA? 提示　限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識別一種特定的堿基序列，并在特定的位點上進行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是自身DNA中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。 (2)DNA連接酶 ①作用：將限制酶切割下來的DNA片段拼接成新的DNA分子。恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。 ②類型 ③DNA連接酶和限制酶的關(guān)系 (3)載體 ①載體的作用：攜帶外源DNA片段進入受體細(xì)胞。 ②常用載體：質(zhì)粒。其他載體：λ噬菌體衍生物、動植物病毒等。 ③質(zhì)粒 a．概念：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。 b．特點：能自我復(fù)制；有一個至多個限制酶切割位點；有特殊標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。 二、基因工程的基本操作程序 1．目的基因的獲取 目的基因：主要指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具調(diào)控作用的因子。 (1)從基因文庫中獲取 ①前提條件：目的基因序列未知。 ②基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，可分為基因組文庫和部分基因文庫(如cDNA文庫)。 ③構(gòu)建過程 (2)利用PCR技術(shù)擴增目的基因 ①PCR含義：是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。 ②PCR原理：DNA雙鏈復(fù)制。 ③前提條件：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。 ④要求 模板：目的基因兩條鏈。 原料：四種脫氧核苷酸。 酶：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)。 引物：人工合成的兩條DNA片段(引物1，引物2)。 ⑤PCR反應(yīng)過程 ⑥方式：指數(shù)形式擴增(2n，n為擴增循環(huán)的次數(shù))。 ⑦結(jié)果：短時間內(nèi)大量擴增目的基因。 (3)人工合成 ①前提條件：核苷酸序列已知，基因比較小。 ②方法 a．反轉(zhuǎn)錄法：目的基因的mRNA單鏈DNA雙鏈DNA(目的基因) b．化學(xué)合成法：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列目的基因 2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心 (1)操作目的 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 (2)組成 (3)構(gòu)建過程 [深入思考]　獲取目的基因與切割載體時只能用同一種限制酶嗎？ 提示　不是只能用一種限制酶，也可以用不同的限制酶，只要切割后目的基因和載體的黏性末端相同即可。 3．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 (1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 ①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：最常用的方法。 a．受體細(xì)胞：植物體細(xì)胞或受精卵。 b．操作過程：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的TDNA上―→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌―→導(dǎo)入植物細(xì)胞―→TDNA上的目的基因整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上―→目的基因表達(dá)。 ②基因槍法：適用于單子葉植物，成本較高。 ③花粉管通道法：將目的基因通過花粉管通道導(dǎo)入受體細(xì)胞，十分簡便經(jīng)濟。 (2)將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞 ①方法：顯微注射技術(shù)。 ②受體細(xì)胞：動物的受精卵。 ③操作過程：將含有目的基因的表達(dá)載體提純―→取卵(受精卵)―→顯微注射―→受精卵經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi)―→獲得具有新性狀的動物。 [深入思考]　獲得轉(zhuǎn)基因動物時，通常選擇受精卵做受體細(xì)胞的原因？ 提示　受精卵全能性高，可使目的基因在相應(yīng)的組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。 (3)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 ①轉(zhuǎn)化方法 a．用Ca2＋處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞)。 b．感受態(tài)細(xì)胞吸收重組表達(dá)載體DNA分子。 ②受體細(xì)胞：原核細(xì)胞(使用最廣泛的是大腸桿菌)。 ③原核生物的特點：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少等。 4．目的基因的檢測與鑒定 (1)不論是復(fù)制水平、轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平的檢測，都是在體外進行的。 (2)在DNA分子、mRNA分子上檢測目的基因是否插入、目的基因是否轉(zhuǎn)錄時，用的探針都是用放射性同位素等作標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段。 三、基因工程的應(yīng)用 1．轉(zhuǎn)基因植物 植物基因工程技術(shù)主要用于提高農(nóng)作物的抗逆能力(如抗除草劑、抗蟲、抗病、抗干旱和抗鹽堿等)，以及改良農(nóng)作物的品質(zhì)和利用植物生產(chǎn)藥物等方面。 2．轉(zhuǎn)基因動物 動物基因工程在動物品種改良、建立生物反應(yīng)器、器官移植等方面顯示了廣闊的應(yīng)用前景。 3．基因工程藥物 (1)來源：轉(zhuǎn)基因的工程菌。 (2)成果：細(xì)胞因子、抗體、疫苗、激素等。 (3)作用：用來預(yù)防和治療人類腫瘤、心血管疾病、遺傳病、各種傳染病、糖尿病、類風(fēng)濕等疾病。 4．基因治療 (1)方法：把正?；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能。 (2)效果：治療遺傳病的最有效的手段。 (3)分類：體內(nèi)基因治療和體外基因治療。 四、蛋白質(zhì)工程 1．概念：蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需求。 2．基本途徑：預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計預(yù)期蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列→找到對應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)。 考點題型突破 考點1　　基因工程的操作工具 題型一 限制性核酸內(nèi)切酶及DNA連接酶等酶的作用 1．(2016全國卷Ⅲ)圖a中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內(nèi)切酶的識別序列與切割位點，圖b為某種表達(dá)載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。 根據(jù)基因工程的有關(guān)知識，回答下列問題： (1)經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被________酶切后的產(chǎn)物連接，理由是_________________________ _________________________________________________________。 (2)若某人利用圖b所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖c所示。這三種重組子中，不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有________，不能表達(dá)的原因是____________ ________________________________________________________。 (3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有____________________和________________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是________________。 答案　(1)Sau3AⅠ　兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙　甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄(其他合理答案也可) (3)Ecoli DNA連接酶　T4DNA連接酶　T4DNA連接酶(其他合理答案也可) 解析　(1)分析圖a可知，限制酶Sau3A Ⅰ與BamH Ⅰ切割DNA后形成的黏性末端相同，故經(jīng)這兩種酶切割得到的產(chǎn)物可以用DNA連接酶進行連接。 (2)構(gòu)建基因表達(dá)載體時，為保證目的基因能在宿主細(xì)胞中成功表達(dá)，目的基因應(yīng)插入在啟動子和終止子之間，據(jù)此可判斷甲、丙均不符合要求，目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄。 (3)常見的DNA連接酶有Ecoli DNA連接酶和T4DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。 知識拓展 與DNA相關(guān)的六種酶的比較 題型二 載體的作用及特點 2．(2016全國卷Ⅰ)某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamH Ⅰ酶切后，與用BamH Ⅰ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問題： (1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有______________________________(答出兩點即可)，而作為基因表達(dá)載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。 (2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是________________________________________________；并且____________和____________________________________________的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是_______________________________。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有________________的固體培養(yǎng)基。 (3)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復(fù)制所需的原料來自于______________。 答案　(1)能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因 (2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長　含有質(zhì)粒載體　含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或含有重組質(zhì)粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長　四環(huán)素 (3)受體細(xì)胞 解析　(1)質(zhì)粒作為載體應(yīng)具備的基本條件有：能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因、含有一至多個限制酶切割位點等。 (2)由題意可知，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞中均不含有氨芐青霉素抗性基因，所以在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上均不能生長。質(zhì)粒載體上含有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，插入了目的基因的重組質(zhì)粒中僅含有氨芐青霉素抗性基因(四環(huán)素抗性基因被破壞)，所以含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的細(xì)胞均能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，但前者可以在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長而后者不能，所以可用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基，篩選出含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落。 (3)噬菌體屬于病毒，病毒增殖過程中所需的原料、酶等均來自于受體細(xì)胞。 考點2　　基因工程的基本操作程序 題型一 目的基因的獲取 1．基因工程又稱為DNA重組技術(shù)，回答相關(guān)問題： Ⅰ.(1)在基因工程中，獲取目的基因主要有兩大途徑，即________和從________中分離。 (2)利用某植物的成熟葉片為材料，同時構(gòu)建cDNA文庫和基因組文庫，兩個文庫相比，cDNA文庫中含有的基因數(shù)目比基因組文庫中的少，其原因是________________________。 (3)在基因表達(dá)載體中，啟動子是________聚合酶識別并結(jié)合的部位。若采用原核生物作為基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，最常用的原核生物是________。 Ⅱ.將外源生長激素基因?qū)刖d羊體內(nèi)，轉(zhuǎn)基因綿羊的生長速度比一般綿羊提高30%，體型增大50%。外源生長激素基因除可以從基因組文庫中獲取外，還可通過以下途徑合成：一是利用從供體動物的________細(xì)胞中提取的mRNA，在________酶催化下合成；二是通過分析生長激素的________序列推測基因的結(jié)構(gòu)，進而人工合成。這兩種途徑合成的生長激素基因________(填“相同”或“不同”)，原因是_____________________________________________________。 答案?、?(1)人工合成　已有物種 (2)cDNA文庫中只含有葉片細(xì)胞已轉(zhuǎn)錄(或已表達(dá))的基因，而基因組文庫中含有該植物的全部基因 (3)RNA　大腸桿菌 Ⅱ.垂體　逆轉(zhuǎn)錄　氨基酸　不同　一種氨基酸可能不只由一種密碼子決定(密碼子的簡并性) 解析?、?(1)獲取目的基因的途徑，一是人工合成，二是從自然界已有物種中分離。 (2)基因組文庫中含有該植物的所有基因，而cDNA文庫中只含有已經(jīng)轉(zhuǎn)錄的基因。 (3)啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位；最常用的原核生物受體細(xì)胞是大腸桿菌。 Ⅱ.生長激素是垂體合成分泌的，故只有在垂體細(xì)胞中才能提取到生長激素基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA，再在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下合成生長激素基因；也可以通過分析生長激素的氨基酸序列，推測出其mRNA中的堿基序列，進而推測出生長激素基因中的堿基序列，最后用化學(xué)方法人工合成。因為決定氨基酸的密碼子具有簡并性，因而這兩種方法合成的生長激素基因結(jié)構(gòu)可能不同。 技法提升 獲取目的基因的方法選擇 (1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通過構(gòu)建基因文庫的方法，即通過受體菌儲存并擴增目的基因后，從基因文庫中獲取目的基因。 (2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比較小，可以通過DNA合成儀利用化學(xué)方法直接人工合成。 (3)如果知道要擴增的目的基因及兩端的核苷酸序列，而且基因又比較大，可以通過PCR技術(shù)擴增目的基因。 題型二 PCR技術(shù)原理及應(yīng)用 2．多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，其簡要過程如圖所示。下列關(guān)于PCR技術(shù)敘述不正確的是(　　) A．PCR技術(shù)是在實驗室中以少量DNA制備大量DNA的技術(shù) B．反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板 C．PCR技術(shù)中以核糖核苷酸為原料，以指數(shù)方式擴增 D．應(yīng)用PCR技術(shù)與探針雜交技術(shù)可以檢測基因突變 答案　C 解析　PCR技術(shù)是體外大量擴增DNA的技術(shù)，即以少量DNA制備大量DNA的技術(shù)，A正確；PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制，反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板，所需原料是脫氧核苷酸，并以指數(shù)方式擴增，B正確，C錯誤。 3．(2017江蘇高考)金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計劃通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴增過程示意圖如下，請回答下列問題： (1)從高表達(dá)MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過________獲得________用于PCR擴增。 (2)設(shè)計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)，為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)腳___________________位點。設(shè)計引物時需要避免引物之間形成________，而造成引物自連。 (3)圖中步驟1代表________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個步驟組成一輪循環(huán)。 (4)PCR擴增時，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過高會破壞________的堿基配對。退火溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，長度相同但________的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。 (5)如果PCR反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物，則可以采取的改進措施有________(填序號：①升高退火溫度?、诮档屯嘶饻囟取、壑匦略O(shè)計引物)。 答案　(1)逆轉(zhuǎn)錄　cDNA (2)限制性核酸內(nèi)切酶　堿基互補配對 (3)變性 (4)引物與模板　GC含量高 (5)②③ 解析　(1)目的基因的獲取：從高表達(dá)MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA用于PCR的擴增。 (2)設(shè)計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)，為方便基因與載體相連構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點。為了避免引物自連，設(shè)計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對。 (3)根據(jù)PCR的過程可知，圖中步驟1為變性，步驟2為退火，步驟3為延伸，這三個步驟構(gòu)成一輪循環(huán)。 (4)退火溫度過高，會破壞引物與模板的堿基配對。因A、T之間形成兩個氫鍵，G、C之間形成三個氫鍵，形成G、C堿基對需要更多的能量，故需要更高的溫度。 (5)如果PCR反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物，可能的原因是退火溫度過高，或者設(shè)計的引物不合適，不能與模板結(jié)合。因此可采取的改進措施有降低退火溫度、重新設(shè)計引物等。 知識拓展 PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的異同點 題型三 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 4．在基因表達(dá)載體的構(gòu)建中，下列說法不正確的是(　　) ①一個表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子 ②有了啟動子才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA ③終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止 ④所有基因表達(dá)載體的構(gòu)建是完全相同的 A．②③ B．①② C．①④ D．③④ 答案　C 解析　一個表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因等，①錯誤；啟動子能啟動轉(zhuǎn)錄過程，即有了啟動子才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，②正確；終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止，③正確；不同的基因表達(dá)載體構(gòu)建方法不同，④錯誤。綜上所述，C符合題意。 5．(2016江蘇高考)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請回答下列問題： (1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于________態(tài)的大腸桿菌中。 (2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中________________________。 (3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為________，對于該部位，這兩種酶________(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。 (4)若用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。 答案　(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA連接　感受 (2)四環(huán)素　引物甲和引物丙 (3)　都不能 (4)7 解析　(1)由題圖可知，質(zhì)粒的兩個標(biāo)記基因中都含有BamHⅠ的切點，因此不能用BamHⅠ進行切割，結(jié)合題干及表中信息可知質(zhì)粒中不含Sau3AⅠ的切點，因此也不能用Sau3AⅠ進行切割，所以只能用質(zhì)粒中和目的基因兩端都含有切點的BclⅠ和HindⅢ這兩種限制酶來切割目的基因和質(zhì)粒。酶切后的載體和目的基因片段，通過DNA連接酶作用后獲得重組質(zhì)粒。要將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，要先用CaCl2處理大腸桿菌，使其處于感受態(tài)。 (2)重組質(zhì)粒中只含有四環(huán)素抗性基因這一個標(biāo)記基因，所以為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌能在該平板上長出菌落。要用PCR擴增目的基因，所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙，因為從圖2中可以看出，引物甲與引物丙與模板鏈結(jié)合后能完成目的基因的復(fù)制。 (3)BamHⅠ酶切的DNA末端是，BclⅠ酶切的DNA末端是，這兩個末端連接后的連接部位的6個堿基對序列為，由于連接后的6個堿基對序列中沒有BamHⅠ和BclⅠ能識別的酶切位點，故對于該部位BamHⅠ和BclⅠ都不能將其切開。 (4)因為質(zhì)粒的BamHⅠ和BclⅠ識別序列中都有Sau3AⅠ的識別序列和切割位點，所以用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ切點及得到的7種大小不同的DNA片段情況如下：①切點在1或2或3的位置可以分別得到1種DNA分子，但其大小相同；②切點在1和2的位置可以得到2種DNA分子；③切點在1和3的位置可以得到2種DNA分子；④切點在2和3的位置可以得到2種DNA分子，故最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。 技法提升 1.基因表達(dá)載體構(gòu)建時限制酶的選擇 (1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類 ①應(yīng)選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。 ②不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。 ③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點)。 (2)根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類 ①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致(也可以是能形成相同黏性末端的不同限制酶)，以確保具有相同的黏性末端。 ②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標(biāo)記基因；如果所選酶的切點不止一個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制起點區(qū)，則切割重組后的片段進入受體細(xì)胞后將不能自主復(fù)制。 2.基因表達(dá)載體中啟動子、終止子的來源 (1)如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，目的基因中已含有啟動子、終止子，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，不需要在質(zhì)粒上接上特定的啟動子、終止子。 (2)如果目的基因是通過人工方法合成的，或通過cDNA文庫獲得的，則目的基因是不含啟動子和終止子的。因此，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，需要在與質(zhì)粒結(jié)合之前，在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。 題型四 目的基因的導(dǎo)入與檢測 6．下面為利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關(guān)敘述，正確的是(　　) A．②的構(gòu)建需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA聚合酶參與 B．③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上 C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲性狀 D．⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異 答案　D 解析　構(gòu)建重組質(zhì)粒需要用到限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，不需要DNA聚合酶，A錯誤；含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒的TDNA整合到受體細(xì)胞的染色體上，而不是重組Ti質(zhì)粒整合到受體細(xì)胞的染色體上，B錯誤；導(dǎo)入受體細(xì)胞的目的基因表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因植株方能表現(xiàn)出相應(yīng)性狀，若目的基因在受體細(xì)胞中不表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株不能表現(xiàn)出相應(yīng)性狀，C錯誤；⑤表現(xiàn)出抗蟲性狀則表明該植株細(xì)胞發(fā)生了基因重組，基因重組是可遺傳變異，D正確。 7．(2019威海模擬)科學(xué)家將人的生長激素基因與某種細(xì)菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子進行重組，并成功地在該細(xì)菌中得以表達(dá)(如下圖)。請據(jù)圖分析回答： (1)細(xì)菌是理想的受體細(xì)胞，這是因為它__________________。 (2)質(zhì)粒A與目的基因結(jié)合時，首先需要用________酶將質(zhì)粒切開“缺口”，然后用________酶將質(zhì)粒與目的基因“縫合”起來。 (3)若將細(xì)菌B先接種在含有________的培養(yǎng)基上能生長，說明該細(xì)菌中已經(jīng)導(dǎo)入外源質(zhì)粒，但不能說明外源質(zhì)粒是否成功插入目的基因；若將細(xì)菌B再重新接種在含有________的培養(yǎng)基上不能生長，則說明細(xì)菌B中已經(jīng)導(dǎo)入了插入目的基因的重組質(zhì)粒。 答案　(1)繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少 (2)限制性核酸內(nèi)切　DNA連接 (3)氨芐青霉素　四環(huán)素 解析　(1)細(xì)菌具有繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少等優(yōu)點，因此是基因工程中的理想的受體細(xì)胞。 (2)構(gòu)建基因表達(dá)載體時，需先用限制酶分別切割目的基因和載體，再用DNA連接酶將兩者連接起來。 (3)質(zhì)粒A和重組質(zhì)粒中都有完整的氨芐青霉素抗性基因，因此細(xì)菌有氨芐青霉素抗性說明該細(xì)菌中已經(jīng)導(dǎo)入外源質(zhì)粒，但不能說明外源質(zhì)粒是否成功插入目的基因；重組質(zhì)粒中四環(huán)素抗性基因內(nèi)插入了目的基因，不能表達(dá)，因此若細(xì)菌再對四環(huán)素?zé)o抗性，則說明細(xì)菌B中已經(jīng)導(dǎo)入了插入目的基因的重組質(zhì)粒。 技法提升 如何篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞 (1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。 (2)被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌。 (3)篩選方法：將含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進行培養(yǎng)。 考點3　基因工程的應(yīng)用及蛋白質(zhì)工程 題型一 基因工程的應(yīng)用 1．(2018山東聊城二模)普通番茄細(xì)胞中含有PG基因，其能控制合成多聚半乳糖醛酸酶(簡稱PG)，PG能破壞細(xì)胞壁使番茄軟化不耐貯藏?？茖W(xué)家將抗PG基因?qū)敕鸭?xì)胞，培育出了抗軟化、保鮮時間長的轉(zhuǎn)基因番茄。如圖表示抗PG基因的作用原理，回答下列問題： (1)據(jù)圖回答該轉(zhuǎn)基因番茄具有抗軟化、保鮮時間長的原理是______________________________。 (2)為培育抗軟化番茄，應(yīng)采用________技術(shù)將抗PG基因進行體外擴增。在該技術(shù)的反應(yīng)體系中除模板、引物、原料外，還需要加入________，這個基因的表達(dá)需要________等不可缺少的調(diào)控組件。 (3)將抗PG基因插入Ti質(zhì)粒的________上構(gòu)建基因表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將抗PG基因?qū)敕鸭?xì)胞，為檢驗抗PG基因是否成功表達(dá)，在個體生物學(xué)水平上應(yīng)檢測______________________。 (4)為避免抗PG基因通過花粉傳播進入其他植物而導(dǎo)致“基因污染”，應(yīng)將抗PG基因?qū)隷_______(填“細(xì)胞核”或“細(xì)胞質(zhì)”)。 答案　(1)抗PG基因能阻止PG基因表達(dá)的翻譯過程，使細(xì)胞不能合成PG (2)PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))　熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)　啟動子、終止子 (3)T－DNA　轉(zhuǎn)基因番茄是否抗軟化以及保鮮時間的長短 (4)細(xì)胞質(zhì) 解析　(1)據(jù)題圖可知，抗PG基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA能夠與PG基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA結(jié)合，阻止了PG基因表達(dá)的翻譯過程，使細(xì)胞不能合成PG，不能破壞細(xì)胞壁而使轉(zhuǎn)基因番茄抗軟化且保鮮時間延長。 (2)采用PCR技術(shù)將抗PG基因進行體外擴增；PCR過程所需要的條件有：模板(抗PG基因)、引物、原料(四種游離的脫氧核糖核苷酸)、熱穩(wěn)定DNA聚合酶；啟動子、終止子等是基因表達(dá)不可缺少的調(diào)控組件。 (3)將抗PG基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA上構(gòu)建基因表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將抗PG基因?qū)敕鸭?xì)胞，為檢驗抗PG基因是否成功表達(dá)，在個體生物學(xué)水平上應(yīng)檢測轉(zhuǎn)基因番茄是否抗軟化以及保鮮時間的長短。 (4)花粉中的雄配子幾乎不含質(zhì)基因，所以為避免抗PG基因通過花粉傳播進入其他植物而導(dǎo)致“基因污染”，應(yīng)將抗PG基因?qū)爰?xì)胞質(zhì)。 題后歸納 有關(guān)基因工程應(yīng)用的四個易錯點 (1)動物基因工程主要是為了改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)，而不是為了產(chǎn)生體型巨大的個體。 (2)Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并無毒性，進入昆蟲消化道被分解成多肽后產(chǎn)生毒性。 (3)青霉素是青霉菌產(chǎn)生的，不是通過基因工程產(chǎn)生的。 (4)并非所有個體都可作為乳腺生物反應(yīng)器。操作成功的應(yīng)該是雌性個體，個體本身的繁殖速度較高，泌乳量、蛋白含量等都是應(yīng)該考慮的因素。 題型二 蛋白質(zhì)工程 2．(2015全國卷Ⅱ)已知生物體內(nèi)有一種蛋白質(zhì)(P)，該蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)運蛋白，由305個氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(zhì)(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性?；卮鹣铝袉栴}： (1)從上述資料可知，若要改變蛋白質(zhì)的功能，可以考慮對蛋白質(zhì)的________進行改造。 (2)以P基因序列為基礎(chǔ)，獲得P1基因的途徑有修飾________基因或合成________基因。所獲得的基因表達(dá)時是遵循中心法則的，中心法則的全部內(nèi)容包括________的復(fù)制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即：________________________________。 (3)蛋白質(zhì)工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預(yù)期蛋白質(zhì)功能出發(fā)，通過__________________和__________________，進而確定相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列，據(jù)此獲得基因，再經(jīng)表達(dá)、純化獲得蛋白質(zhì)，之后還需要對蛋白質(zhì)的生物________進行鑒定。 答案　(1)氨基酸序列(或結(jié)構(gòu)) (2)P　P1　DNA和RNA(或遺傳物質(zhì))　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(zhì)(或轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、翻譯) (3)設(shè)計蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)　推測氨基酸序列　功能 解析　(1)從題中所述資料可知，將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸后，該蛋白質(zhì)的功能發(fā)生了改變，此過程是通過對構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行改造，進而改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而改變了蛋白質(zhì)的功能。 (2)在蛋白質(zhì)工程中，目的基因可以以P基因序列為基礎(chǔ)，對生物體內(nèi)原有P基因進行修飾，也可以通過人工合成法合成新的P1基因。所獲得的基因表達(dá)遵循中心法則時，中心法則的全部內(nèi)容包括DNA和RNA復(fù)制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即DNA→RNA，RNA→DNA，RNA→蛋白質(zhì)。 (3)蛋白質(zhì)工程的基本途徑是預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列→合成DNA→表達(dá)出蛋白質(zhì)，經(jīng)過該過程得到的蛋白質(zhì)，需要對其生物功能進行鑒定，以保證其發(fā)揮正常作用。 知識拓展 蛋白質(zhì)工程與基因工程的比較 實驗16　　DNA的粗提取與鑒定 1．DNA粗提取和鑒定的原理 (1)提取思路：利用DNA和其他物質(zhì)在理化性質(zhì)方面的差異，提取DNA。 (2)DNA的理化性質(zhì)(提取和鑒定原理)： ①DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同 ②DNA不溶于酒精； ③對酶、高溫和洗滌劑的耐受性強； ④DNA＋二苯胺試劑藍(lán)色。 2．DNA粗提取和鑒定的操作流程 1．(2018揚州江都中學(xué)段考)下列有關(guān)“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是(　　) A．DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸餾水 B．向雞血細(xì)胞液中加蒸餾水是為了釋放出DNA C．向濃鹽溶液中加蒸餾水是為了析出DNA D．用菜花替代雞血做實驗，其實驗操作步驟相同 答案　D 解析　DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸餾水，A正確；向雞血細(xì)胞液中加蒸餾水是為了讓雞血細(xì)胞吸水漲破，從而釋放出DNA，B正確；向溶解DNA的濃鹽溶液中加蒸餾水是為了降低DNA的溶解度，進而析出DNA，C正確；用菜花替代雞血作為實驗材料，其實驗操作步驟不完全相同，如植物細(xì)胞有細(xì)胞壁，破碎細(xì)胞時需要充分?jǐn)嚢韬脱心ゲ⒓尤胧雏}和洗滌劑，D錯誤。 2．下列關(guān)于“DNA的粗提取和鑒定”實驗依據(jù)原理的敘述，錯誤的是(　　) A．利用DNA不溶于酒精溶液，而蛋白質(zhì)能溶于酒精溶液，可將DNA與蛋白質(zhì)分離 B．利用高溫能使蛋白質(zhì)變性，卻對DNA沒有影響的特性，可將DNA與蛋白質(zhì)分離 C．利用二苯胺與DNA沸水浴呈現(xiàn)藍(lán)色可用于DNA的鑒定 D．在DNA濾液中加入嫩肉粉，通過木瓜蛋白酶的作用，可將DNA與蛋白質(zhì)分離 答案　B 解析　高溫能使蛋白質(zhì)、DNA變性，蛋白質(zhì)在60～80 ℃發(fā)生變性，而DNA在80 ℃以上才變性，不能將DNA與蛋白質(zhì)分離。 3．下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是(　　) 答案　A 解析　蒸餾水與雞血細(xì)胞混合的目的是使紅細(xì)胞吸水漲破，釋放出核物質(zhì)，B錯誤；將蒸餾水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中，其目的是降低DNA的溶解度，初步析出DNA，C錯誤；加入冷卻酒精的目的是進一步析出DNA，D錯誤。 題后歸納 DNA的粗提取與鑒定實驗中的“2、4、4” 方向真題體驗 1．(2018全國卷Ⅱ)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍(lán)光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1－GFP融合基因(簡稱為甲)，并將其插入質(zhì)粒P0，構(gòu)建了真核表達(dá)載體P1，其部分結(jié)構(gòu)和酶切位點的示意圖如下，圖中E1～E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同。 回答下列問題： (1)據(jù)圖推斷，該團隊在將甲插入質(zhì)粒P0時，使用了兩種限制酶，這兩種酶是____________。使用這兩種酶進行酶切是為了保證______________，也是為了保證__________________。 (2)將P1轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛皮膚細(xì)胞后，若在該細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細(xì)胞中完成了________和________過程。 (3)為了獲得含有甲的牛，該團隊需要做的工作包括：將能夠產(chǎn)生綠色熒光細(xì)胞的________移入牛的________________________中、體外培養(yǎng)、胚胎移植等。 (4)為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細(xì)胞中，某同學(xué)用PCR方法進行鑒定。在鑒定時應(yīng)分別以該牛不同組織細(xì)胞中的________(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作為PCR模板。 答案　(1)E1和E4　甲的完整　甲與載體正確連接 (2)轉(zhuǎn)錄　翻譯 (3)細(xì)胞核　去核卵母細(xì)胞 (4)核DNA 解析　(1)甲是將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端而獲得的L1－GFP融合基因，據(jù)此結(jié)合題意并分析圖示可知：該團隊在將甲插入質(zhì)粒P0時，如果用E2或E3，則目的基因不完整，而使用E1和E4這兩種限制酶進行酶切保證了甲的完整，而且也保證了甲與載體正確連接，因此，使用的兩種限制酶是E1和E4。 (2)構(gòu)建的真核表達(dá)載體P1中含有GFP基因，而GFP基因的表達(dá)產(chǎn)物“某種熒光蛋白(GFP)”在紫外光或藍(lán)光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光。若在導(dǎo)入P1的牛皮膚細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細(xì)胞中完成了表達(dá)?；虻谋磉_(dá)過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。 (3)若要獲得含有甲的牛，可采用核移植技術(shù)，即將能夠產(chǎn)生綠色熒光細(xì)胞的細(xì)胞核移入牛的去核卵母細(xì)胞中獲得重組細(xì)胞，并將該重組細(xì)胞在體外培養(yǎng)成重組胚胎，再經(jīng)過胚胎移植等獲得含有甲的牛。 (4)PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，是一種在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。若利用PCR方法檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細(xì)胞中，則應(yīng)分別以該牛不同組織細(xì)胞中的核DNA作為PCR模板。 2．(2018江蘇高考)為生產(chǎn)具有特定性能的α－淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α－淀粉酶基因(1656個堿基對)，利用基因工程大量制備α－淀粉酶，實驗流程如圖。請回答下列問題： (1)利用PCR技術(shù)擴增α－淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的________。 (2)為了便于擴增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的________端加上限制性酶切位點，且常在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是________________________________________________。 (3)進行擴增時，反應(yīng)的溫度和時間需根據(jù)具體情況進行設(shè)定，下列選項中________的設(shè)定與引物有關(guān)，________的設(shè)定與擴增片段的長度有關(guān)。(填序號) ①變性溫度?、谕嘶饻囟取、垩由鞙囟取、茏冃詴r間 ⑤退火時間　⑥延伸時間 (4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α－淀粉酶的mRNA 的部分堿基序列： 5′－U……－3′ 圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含________個密碼子，如虛線框后的序列未知，預(yù)測虛線框后的第一個密碼子最多有________種。 (5)獲得工程菌表達(dá)的α－淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測定酶活性，結(jié)果如下： 根據(jù)上述實驗結(jié)果，初步判斷該α－淀粉酶活性最高的條件為____________________________________________________。 答案　(1)基因組DNA (2)5′　使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連 (3)②　⑥　(4)8　13 (5)pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L Tirs－HCl 解析　(1)由題干信息可知某種海洋細(xì)菌含有α－淀粉酶基因，因此在擴增α－淀粉酶基因前需先從細(xì)菌中提取細(xì)菌的基因組DNA。 (2)由于引物的作用是引導(dǎo)子鏈的延伸，將脫氧核苷酸連接到引物上時，是與引物的3′端相連的，由此確定需在引物的5′端加上限制性酶切位點。常在兩條引物上加入不同的限制酶切位點的主要目的是使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，防止自身相連。 (3)進行PCR擴增時，退火的溫度與引物長短和堿基種類有關(guān)。延伸時間長短的設(shè)定與擴增片段的長度有關(guān)。 (4)密碼子是指mRNA上決定一個氨基酸的三個相鄰的堿基，該mRNA 上5′端為AUG(起始密碼子)，因此可依據(jù)三個堿基是一個密碼子來分析圖中虛線框中的堿基，可得出共有8個密碼子。由于虛線框后的第一個密碼子的第一個堿基已經(jīng)固定為U，因此還有2個堿基未知，共可能有的種數(shù)為44＝16，又因為UAG、UGA、UAA為終止密碼子，因此決定氨基酸的密碼子最多有13種。 (5)據(jù)表格數(shù)據(jù)可知：α－淀粉酶在pH為8.5、緩沖液為50 mmol/L Tris－HCl的條件下相對活性為99.5%，初步判斷此條件下酶活性最高。 3．(2018天津高考)甲型流感病毒為RNA病毒，易引起流感大規(guī)模流行。我國科學(xué)家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環(huán)節(jié)如下。 (1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成對應(yīng)DNA后，利用________技術(shù)擴增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達(dá)時不能合成完整長度的________，因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原基因等其他基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒，并保存。 (2)構(gòu)建適合改造病毒增殖的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。設(shè)計合成一種特殊tRNA的基因，其產(chǎn)物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結(jié)合，并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與________連接后導(dǎo)入宿主細(xì)胞。提取宿主細(xì)胞的________進行分子雜交鑒定，篩選獲得成功表達(dá)上述tRNA的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。 (3)利用轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞制備疫苗。將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，并在補加________的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，則該宿主細(xì)胞能利用上述特殊tRNA，翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，產(chǎn)生大量子代病毒，用于制備疫苗。特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄時，識別其啟動子的酶是________(單選)。 A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶 C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶 (4)上述子代病毒不能在正常宿主細(xì)胞中增殖，沒有致病性，因此不經(jīng)滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比，該病毒活疫苗的優(yōu)勢之一是可引起________免疫，增強免疫保護效果。 答案　(1)PCR　多肽(或蛋白質(zhì)) (2)載體　總RNA (3)非天然氨基酸(Uaa)　D (4)細(xì)胞 解析　(1)利用PCR技術(shù)體外擴增DNA。若將基因中個別編碼氨基酸的序列替換為編碼終止密碼子的序列，則改造后的基因轉(zhuǎn)錄合成的mRNA中，終止密碼子提前出現(xiàn)，將不能控制合成完整長度的多肽(或蛋白質(zhì))。 (2)目的基因只有與載體連接后才能導(dǎo)入宿主細(xì)胞?？商崛∷拗骷?xì)胞的總RNA進行分子雜交鑒定，以篩選獲得成功表達(dá)題述tRNA的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。 (3)由(2)知，轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞含有的特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄的tRNA，該tRNA的反密碼子可與終止密碼子配對，并可攜帶非天然氨基酸(Uaa)，所以培養(yǎng)基中需補加非天然氨基酸(Uaa)。病毒中的基因進行轉(zhuǎn)錄時，識別其啟動子的酶是宿主的RNA聚合酶。 (4)因該病毒疫苗具有侵染性，故可引起細(xì)胞免疫。 4．(2018全國卷Ⅰ)回答下列問題： (1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Coben)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進行了表達(dá)，該研究除證明了質(zhì)?？梢宰鳛檩d體外，還證明了_____________________(答出兩點即可)。 (2)體外重組的質(zhì)粒可通過Ca2＋參與的________方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，而體外重組的噬菌體DNA通常需與______________組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在細(xì)菌、心肌細(xì)胞、葉肉細(xì)胞中，可作為重組噬菌體宿主細(xì)胞的是____________。 (3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時，表達(dá)出的蛋白質(zhì)可能會被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解，在實驗中應(yīng)選用__________________的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應(yīng)添加________的抑制劑。 答案　(1)體外重組的質(zhì)粒可以進入受體細(xì)胞；真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達(dá) (2)轉(zhuǎn)化　外殼蛋白(噬菌體蛋白)　細(xì)菌 (3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶 解析　(1)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進行了表達(dá)，該過程證明了體外重組的質(zhì)?？梢赃M入受體細(xì)胞，真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)等。 (2)用Ca2＋處理大腸桿菌細(xì)胞，可以增大細(xì)胞膜的通透性，使重組的質(zhì)粒更容易導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)，因此體外重組的質(zhì)粒可通過Ca2＋參與的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞。體外重組的噬菌體DNA通常需與蛋白質(zhì)外殼組裝成完整的噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組噬菌體DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。噬菌體主要寄生在細(xì)菌體內(nèi)，而不能寄生在其他細(xì)胞中，因此可作為重組噬菌體宿主細(xì)胞的是細(xì)菌。 (3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時，表達(dá)出的蛋白質(zhì)可能會被降解，為防止蛋白質(zhì)被降解，可以選用不能產(chǎn)生該蛋白酶的缺陷細(xì)菌以及使用能夠抑制蛋白酶活性的藥物，因此為防止蛋白質(zhì)被降解，在實驗中應(yīng)選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應(yīng)添加蛋白酶的抑制劑。 5．(2017全國卷Ⅰ)真核生物基因中通常有內(nèi)含子，而原核生物基因中沒有，原核生物沒有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列的機制。已知在人體中基因A(有內(nèi)含子)可以表達(dá)出某種特定蛋白(簡稱蛋白A)。回答下列問題： (1)某同學(xué)從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細(xì)胞卻未得到蛋白A，其原因是____________________________ ________________________________________________________。 (2)若用家蠶作為表達(dá)基因A的受體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用________作為載體，其原因是 _________________________________________________________。 (3)若要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。因為與家蠶相比，大腸桿菌具有 ____________________________________________________________(答出兩點即可)等優(yōu)點。 (4)若要檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用的檢測物質(zhì)是________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”)。 (5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗為證明DNA是遺傳物質(zhì)做出了重要貢獻，也可以說是基因工程的先導(dǎo)，如果說他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是 _________________________________________________________。 答案　(1)基因A有內(nèi)含子，在大腸桿菌中，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列不能被切除，無法表達(dá)出蛋白A (2)噬菌體　噬菌體的宿主是細(xì)菌，而不是家蠶 (3)繁殖快、容易培養(yǎng) (4)蛋白A的抗體 (5)DNA可以從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體 解析　(1)人是真核生物，從人的基因組文庫中獲得的基因A有內(nèi)含子，而受體細(xì)胞大腸桿菌是原核生物，原核生物基因中沒有內(nèi)含子，相應(yīng)的就沒有切除內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列的機制，故無法表達(dá)出蛋白A。 (2)噬菌體是專一性侵染細(xì)菌的病毒，以細(xì)菌為宿主細(xì)胞，而昆蟲病毒侵染的是昆蟲，以昆蟲為宿主細(xì)胞。家蠶屬于昆蟲，故應(yīng)選用昆蟲病毒作為載體。 (3)與家蠶相比，大腸桿菌具有繁殖快、容易培養(yǎng)等優(yōu)點，故要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。 (4)檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用相應(yīng)的抗體即蛋白A的抗體進行抗原—抗體雜交。 (5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗中，S型細(xì)菌的DNA可以使R型細(xì)菌發(fā)生轉(zhuǎn)化，說明可調(diào)控多糖莢膜產(chǎn)生的基因整合到了R型細(xì)菌的DNA分子中并成功得以表達(dá)。也就是說DNA可以從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體并進行表達(dá)，這就為基因工程理論的建立提供了啟示。