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第二章.細(xì)胞生物學(xué)研究方法,顯微成像技術(shù)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(cytochemistry)細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞融合分離技術(shù)分子生物學(xué)方法,顯微成像技術(shù),光學(xué)和電子顯微鏡成像原理三個基本要素:①照明系統(tǒng)，②被觀察的樣品，③聚焦和成像的透鏡系統(tǒng)常用的光學(xué)顯微鏡普通雙筒顯微鏡(binocularmicroscope)熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)倒置顯微鏡,光學(xué)和電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu),分辨率(resolution),R=0.61λ/nSinαn=聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)的折射率.空氣為1.油為1.5;α=樣品對物鏡角孔徑的半角，sinα的最大值為1;λ=照明光源的波長。0.61是一個恒定的參數(shù)，表示成像的點雖被重疊但仍能被區(qū)別的程度數(shù)值孔徑越大，進(jìn)入物鏡的光越多；介質(zhì)的折射率越大，則數(shù)值孔徑越大，這些都可以使分辨率提高,表2-2電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別,,,電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別,細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(cytochemistry),酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(enzymecytochemistry)通過酶的特異細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)來顯示酶在細(xì)胞內(nèi)的定位免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)利用免疫反應(yīng)定位組織或細(xì)胞中抗原成分分布的一類技術(shù)。主要分為兩大類:免疫熒光技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)。,分離技術(shù),分離技術(shù)是一大類技術(shù)的總稱，包括細(xì)胞組分的分離和生物大分子的分離細(xì)胞組分的分級分離差速離心:低速高速密度梯度離心:離心介質(zhì)(蔗糖.甘油.氯化銫),,差速離心的原理,密度梯度離心分離溶酶體、線粒體和微體,CsCl密度梯度離心分離DNA,細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture),在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體中取出的細(xì)胞，并使之生存和生長的技術(shù)為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。體外細(xì)胞培養(yǎng)的條件物質(zhì)營養(yǎng)生存環(huán)境廢物的排除,原代培養(yǎng)(primaryculture),直接從機體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng),,■細(xì)胞系和細(xì)胞株(celllineandcellstrain)●細(xì)胞系:原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系，●細(xì)胞株:從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系由單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群稱細(xì)胞株?！鰟游锛?xì)胞培養(yǎng)方法●貼壁培養(yǎng)分散的細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)瓶中很快(幾十分鐘至幾小時)就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁，貼壁后的細(xì)胞形態(tài)形成多態(tài)性，呈單層生長，所以此法又叫單層細(xì)胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)的細(xì)胞保持接觸抑制(contactinhibition)的特性。懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不貼壁，一直懸浮在培養(yǎng)液中生長，如T細(xì)胞的培養(yǎng)就是如此。懸浮培養(yǎng)的條件較為復(fù)雜，難度也大一些，但是容易同時獲得大量的培養(yǎng)細(xì)胞,細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù),細(xì)胞融合(cellfusion)指自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，兩個不同基因型的細(xì)胞或原生質(zhì)體融合形成一個雜種細(xì)胞(圖2-33)。單克隆抗體技術(shù)(monoclonalantibodytechnique)1975年英國科學(xué)家Milstein和Kohler發(fā)明了單克隆抗體技術(shù)，因此獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎,細(xì)胞融合,單克隆抗體技術(shù),動物細(xì)胞核移植克隆技術(shù),1997年，英國蘇格蘭羅斯林研究所I.WI.Wilmut等首次成功通過細(xì)胞融合技術(shù)利用成年動物徹底分化的體細(xì)胞克隆出子代個體，開創(chuàng)了動物體細(xì)胞克隆的新時代,分子生物學(xué)方法,基因工程技術(shù)(geneengineering)PCR技術(shù)選擇性基因敲除(geneknockout)與敲進(jìn)(geneknockin)乳腺生物反應(yīng)器技術(shù),基因克隆(genecloning),這項技術(shù)可概括為∶分、切、連、轉(zhuǎn)、選,PCR技術(shù),PCR是英文聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)的簡稱，是80年代發(fā)展起來的一項具有重大意義的分子生物學(xué)技術(shù),轉(zhuǎn)基因敲除小鼠的獲得,利用同源重組(基因打靶)使基因失活的方法基因敲除是一套組合技術(shù)，包括基因重組、細(xì)胞分離、轉(zhuǎn)基因等兩個關(guān)鍵技術(shù):體外重組與轉(zhuǎn)基因鼠,基因敲進(jìn)(knockinofgene),將外源有功能的基因(基因組中原先不存在.或已失活的基因),轉(zhuǎn)如細(xì)胞與基因組中的同源序列進(jìn)行同源重組,插入到基因組中,在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá),稱為基因敲進(jìn).,乳腺生物反應(yīng)器技術(shù),乳腺生物反應(yīng)器是根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)中蛋白質(zhì)合成與分選的機理，結(jié)合基因工程技術(shù)、動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)等，利用動物的乳腺分泌某些具有重要價值的基因產(chǎn)物(,胡克和列文虎克發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的動機是不同的，你對此有何感想?,觀察力和對自然現(xiàn)象的好奇心，以及對事業(yè)的責(zé)任感才導(dǎo)致細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)。,