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病毒感染性疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷,1,病毒的發(fā)現(xiàn)與研究歷史,病毒病由來已久 公元前二至三個(gè)世紀(jì) 天花 中國 公元十世紀(jì) 接種人痘預(yù)防天花 1796英國醫(yī)生琴納 牛痘使人預(yù)防天花 阿里斯多德在公元前四世紀(jì) 狂犬病 法國人巴斯德在1884年 狂犬疫苗,2,病毒學(xué)的發(fā)展歷程,病毒的病原研究階段 病毒的化學(xué)和結(jié)構(gòu)研究階段 病毒研究的細(xì)胞水平時(shí)期 分子病毒學(xué)的研究時(shí)期,3,病毒病的病原研究階段,自病毒發(fā)現(xiàn)直到上個(gè)世紀(jì)30年代初，病毒學(xué)研究主要集中在：分離和鑒定 引起各種病毒性疾病的病毒；病毒對(duì)疾體所引起的特異性病理效應(yīng)；病毒 的傳播方式和感染宿主范圍；各種理化因子對(duì)病毒感染的影響等方面。 在這一階段，人們對(duì)病毒本質(zhì)的認(rèn)識(shí)還很膚淺，認(rèn)為病毒是一種與細(xì)菌類 似的病原體，所不同的僅在于病毒必須在生活的細(xì)胞內(nèi)才能繁殖，再就是 體積十分微小，以致在顯微鏡下不能見到，能夠通過細(xì)菌濾器。這也正是 在那一時(shí)期把病毒稱之為“超顯微的濾過性病毒”的原因。,4,病毒的化學(xué)和結(jié)構(gòu)研究階段,1934年M.Schlesinger獲得了純化的噬菌體；1935年，美國生化學(xué)家Stanley第一次提純了煙草花葉病毒（簡稱TMV），因?yàn)檫@項(xiàng)貢獻(xiàn) 1946年被授予諾貝爾獎(jiǎng)，這是病毒學(xué)領(lǐng)域第一個(gè)獲此殊榮的科學(xué)家；1938年W.J.Elford測定了各種病毒顆粒大?。?1939年，G.A.Kansche在電鏡下直接觀察到TMV ；1955年，Scaffer和Schwerdt成功結(jié)晶了脊髓灰質(zhì)炎病毒，這是第一個(gè)被結(jié)晶出來的動(dòng)物病毒；等等。 這一階段，病毒學(xué)工作者主要采用敏感動(dòng)物（如小白鼠）或動(dòng)物胚胎（如雞胚）來研究病毒，分離鑒定了近百種病毒。同時(shí)在機(jī)體水平上研究了病毒的繁殖、發(fā)病機(jī)理和免疫反應(yīng)等。只是微生物學(xué)的一個(gè)分支。,5,病毒的細(xì)胞水平研究時(shí)期,利用大腸桿菌研究噬菌體的感染過程取得了迅速發(fā)展 組織培養(yǎng)技術(shù)開始應(yīng)用于動(dòng)物病毒的研究 我國學(xué)者黃禎祥早在1943年就利用雞胚組織塊在試管內(nèi)進(jìn)行病毒傳代、定量滴定及中和試驗(yàn)。 組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)動(dòng)物病毒研究所作的貢獻(xiàn)主要包括：病毒轉(zhuǎn)錄新途徑和翻譯新途徑的發(fā)現(xiàn)；病毒對(duì)宿主范圍的選擇；某些腫瘤病毒引起的細(xì)胞轉(zhuǎn)化；某些病毒侵染引起的細(xì)胞融合；發(fā)現(xiàn)有的病毒核酸由若干片段組成；有的病毒核酸具有極性的不同，如小RNA病毒為正鏈RNA病毒，正粘病毒為負(fù)鏈RNA病毒。 植物病毒不斷有重要的發(fā)現(xiàn) 此階段，病毒學(xué)逐步形成了一門獨(dú)立的學(xué)科。,6,分子病毒學(xué)的研究時(shí)期,自從1953年DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)理論建立以來，由于分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，使病毒學(xué)的研究步入了分子病毒學(xué)的發(fā)展時(shí)期，分子病毒學(xué)也正是分子生物學(xué)的發(fā)展過程中應(yīng)運(yùn)而生。分子病毒學(xué)的發(fā)展是各相關(guān)學(xué)科如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)與病毒學(xué)理論和技術(shù)相互滲透的結(jié)果。尤其是分子生物學(xué)新技術(shù)的發(fā)明極大剌激了分子病毒學(xué)的發(fā)展。,7,分子病毒學(xué)的研究時(shí)期的研究成果（一）,8,分子病毒學(xué)的研究時(shí)期的研究成果（二）,9,病毒感染性疾病,肝炎病毒（Hepatitis Virus） 人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV） 人乳頭瘤狀病毒（human papillomavirus , HPV ） EB病毒（Ebstein-Barr Virus, EBV） SARS冠狀病毒(SARS-associated coronavirus, SARS-CoV) 甲型H1N1流感病毒（Influenza A(H1N1) virus ） 手足口病病毒（Hand, foot and mouth disease Virus ）,10,肝炎病毒（Hepatitis Virus）,引起肝炎的病毒有多種類型，包括甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus, HAV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus, HDV)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)等，分別能夠引起甲型、乙型、丙型、丁型、戊型5種肝炎癥狀。近年又發(fā)現(xiàn)有己型肝炎（HFV引起）和庚型肝炎(HGV引起)出現(xiàn)。,11,（一） 乙型肝炎病毒,結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)： HBsAg：是HBV感染的主要標(biāo)志 HBsAb：保護(hù)性抗體 HBcAg：僅存于感染的肝細(xì)胞核內(nèi)， 　　　　一般不存在于血循環(huán)中 HBcAb: 非保護(hù)性抗體，HBcAb-IgM 　　　　提示HBV處于復(fù)制狀態(tài) HBeAg：HBV復(fù)制及強(qiáng)感染性的指標(biāo) HBeAb：有一定的保護(hù)作用，預(yù)后良好,12,HBV感染的診斷 ELISA方法，但只能提供血清中的HBV間接證據(jù)，無法證明是否具有傳染性檢測血清標(biāo)本中的HBSAg，HbeAg，抗-Hbs，抗-HBc和抗-Hbe（兩對(duì)半）：比較簡單，而且敏感性較低。 內(nèi)源性DNA聚合酶法和斑點(diǎn)雜交分析法：可直接確定臨床標(biāo)本中HBV DNA的存在。比較敏感，能檢測到0.1pg的HBV DNA。 熒光定量PCR方法：可檢測到200copy/ml的HBV DNA。 可 檢出雜交法測定陰性而具有不同HBV血清學(xué)標(biāo)志的血清標(biāo)本中的 HBV DNA。可檢出HBs Ag陽性而Hbe Ag陰性攜帶者的HBV DNA。 可檢出慢性HBV感染α-干擾素治療后轉(zhuǎn)陰的患者血清中殘存的HBV DNA。,（一） 乙型肝炎病毒,13,應(yīng)用核酸擴(kuò)增技術(shù)(NAT)是降低HBV殘留危險(xiǎn)性的重要策略,14,病毒特點(diǎn)： 1. 單正鏈RNA病毒 2. E1和E2區(qū)基因高度變異性,（二）丙型肝炎病毒,感染特點(diǎn)： HCV在血中含量極微 輸血后肝炎主要致病因子 免疫學(xué)標(biāo)志僅有抗-HCV，非中和抗體，產(chǎn)生時(shí)間不一 有一部分人感染HCV后，不產(chǎn)生抗-HCV 感染易于慢性化(50-85%) 疫苗研制尚不成功,單鏈RNA,,15,HCV的流行病學(xué),全世界的感染人群約有1.7億 75% HCV感染發(fā)展成慢性 HCV感染發(fā)展成有癥狀的肝病需要十年以上 可引起慢性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌 通過輸血、靜脈用藥傳播 血清中出現(xiàn)HCV抗體在感染后54－192天,16,ELISA方法檢測HCV抗體：篩查試驗(yàn) RIBA：確證試驗(yàn) HCV RNA檢測：確證試驗(yàn),HCV感染的診斷,17,抗HCV篩查及確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果的解釋,18,HCV-RNA定量檢測的臨床意義 早期診斷： HCV感染1-3W，即可檢出HCV-RNA的存在。 HCV-RNA載量與抗-HCV滴度、ALT水平之間的相關(guān)性：抗-HCV滴 度和ALT異常率隨著HCV-RNA載量升高而增加。 HCV-RNA是評(píng)價(jià)抗病毒治療效果的重要指標(biāo)。 慢性丙型肝炎長期抗-HCV陽性，這時(shí)如果進(jìn)行HCV-RNA 定量檢測 可以鑒別活動(dòng)性、復(fù)制程度。,19,20,人類免疫缺陷病毒(HIV),1982年發(fā)現(xiàn)第1例經(jīng)輸血傳播HIV 1985年開始檢測血液和血液制品 還可通過母嬰垂直傳播和性接觸傳播 可變的潛伏期 普遍的癥狀包括夜汗、體重下降、 腹瀉、鵝口瘡、紫癜 慢性感染，但多種藥物治療可降低病毒滴度,21,人類免疫缺陷病毒(HIV),艾滋病有三個(gè)特性： 獲得性---艾滋病并非先天具有，而是后天獲得。 免疫缺陷---AIDS的發(fā)病機(jī)理在于，HIV通過造成人體免疫系 統(tǒng)的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)防護(hù)功能的減低甚至喪失。 綜合癥---在臨床癥狀方面，由于免疫缺陷導(dǎo)致的各個(gè)系統(tǒng)的 機(jī)會(huì)性感染、腫瘤而出現(xiàn)復(fù)雜的伴隨癥狀群。,22,人類免疫缺陷病毒(HIV),HIV, the virus that causes AIDS, is shown budding out of a human immune cell.,23,人類免疫缺陷病毒(HIV),HIV病毒：多亞型和多變異 HIV-1和HIV-2 M組、O組和N組 亞型：A-K CRF：基因重組亞型，主要是HIV-1型 毒株亞型監(jiān)測的意義 不同亞型與不同傳播途徑的關(guān)系：B主要通過男性同性性行為和靜脈注射吸毒傳播，C主要異性性接觸傳播 流行地理和傳播線路的分析：東南亞區(qū)域的C亞型和B亞型 重組亞型傳播效力變化及對(duì)流行的影響：東歐的B/A重組流行、泰國的A/E重組,24,HIV在外界的抵抗力 HIV病毒一旦離開宿主細(xì)胞在外界環(huán)境中生存能力很快消失 HIV對(duì)環(huán)境中的物理因素和化學(xué)因素抵抗力均較弱，比乙型肝炎病毒（HBV）的抵抗力低得多 對(duì)HBV有效得消毒和滅活方法均適用于HIV,人類免疫缺陷病毒(HIV),25,,HIV感染的三種結(jié)局 典型進(jìn)展者：8-10年潛伏期后成為艾滋病人，80% -90% 快速進(jìn)展者：CD4細(xì)胞2-5年內(nèi)迅速下降，HIV病毒載量一直維持較高水平，而且分離的HIV有均一性。 長期存活者（又稱長期不進(jìn)展者）：維持15年以上，而且CD4計(jì)數(shù)維持正常，在所有感染者中比例一般在8%-10%。,人類免疫缺陷病毒(HIV),26,,HIV感染的三種結(jié)局 典型進(jìn)展者：8-10年潛伏期后成為艾滋病人，80% -90% 快速進(jìn)展者：CD4細(xì)胞2-5年內(nèi)迅速下降，HIV病毒載量一直維持較高水平，而且分離的HIV有均一性。 長期存活者（又稱長期不進(jìn)展者）：維持15年以上，而且CD4計(jì)數(shù)維持正常，在所有感染者中比例一般在8%-10%。,人類免疫缺陷病毒(HIV),27,,HIV抗體的檢測 P24抗原的檢測 HIV 核酸檢測,HIV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷,28,29,,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 明膠凝集試驗(yàn) 各種快速診斷試劑 檢測亞型包括HIV-1、HIV-2和HIV-1型的O亞型，窗口期由10周縮短至3～4周。,HIV抗體的檢測,30,,HIV抗體的檢測 按《規(guī)范》要求，我國采供血機(jī)構(gòu)進(jìn)行血液篩查和各醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)常規(guī)篩查檢測宜采用ELISA法。對(duì)用ELISA試劑或快速診斷試劑進(jìn)行的篩查實(shí)驗(yàn)如呈陰性反應(yīng)，即報(bào)告HIV抗體陰性；對(duì)呈陽性反應(yīng)的標(biāo)本，篩查實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的試劑進(jìn)行重復(fù)檢測，如兩種試劑復(fù)測均呈陰性反應(yīng)，則報(bào)告HIV抗體陰性；如均呈陽性反應(yīng)，或一陰一陽，需送艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)。篩查試劑必須是HIV-1/2混合型、經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局(SDA)注冊(cè)批準(zhǔn)、批檢合格、臨床評(píng)估質(zhì)量優(yōu)良、在有效期內(nèi)的試劑。,人類免疫缺陷病毒(HIV),31,,免疫印跡試驗(yàn) 條帶免疫試驗(yàn) 免疫熒光試驗(yàn),HIV確認(rèn)試驗(yàn),32,,ELISA雙抗體夾心法 陽性結(jié)果必須經(jīng)中和試驗(yàn)確認(rèn)，該結(jié)果才可作為HIV感染的輔助診斷依據(jù)。HIV-1 P24抗原檢測陰性，只表示在本試驗(yàn)中無反應(yīng)，不能排除HIV感染。 在窗口期檢測P24抗原是早期輔助診斷和進(jìn)一步縮短窗口期的一種方法，還可用于HIV陽性母親所生嬰兒的早期輔助鑒別診斷。,P24抗原的檢測,33,,檢測HIV RNA通常使用PCR或RT-PCR技術(shù)， 核酸序列擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)(NASBA)、分支DNA雜交實(shí)驗(yàn)等 注意： HIV核酸定性檢測陰性，只可報(bào)告本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性，但不能排除HIV感染；HIV核酸檢測陽性，可作為診斷HIV感染的輔助指標(biāo)，不能單獨(dú)用于HIV感染的診斷，報(bào)告定性檢測結(jié)果時(shí)還應(yīng)注明反應(yīng)條件和所使用的引物序列。報(bào)告HIV核酸定量檢測結(jié)果時(shí)應(yīng)按照儀器讀數(shù)報(bào)告結(jié)果，注明使用的試驗(yàn)方法、樣品種類和樣品量，當(dāng)測定結(jié)果小于最低檢測限時(shí)，應(yīng)注明最低檢測限水平，低于最低檢測限的結(jié)果不能排除HIV感染。,HIV核酸檢測,34,,CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù) 血漿HIV RNA水平(病毒載量) 這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)可以為臨床醫(yī)生提供病人病毒水平、免疫狀態(tài)的相關(guān)資料，是預(yù)測疾病進(jìn)程的可靠指標(biāo)，還可獨(dú)立預(yù)測艾滋病臨床過程和生存期。,HIV感染的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測,35,,流式細(xì)胞儀是檢測CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以得出CD4+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比值及絕對(duì)值。CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)是艾滋病診斷、疾病分期的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。,CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù),36,,HIV病毒耐藥分為原發(fā)性(Primary)及繼發(fā)性(Secondary) 原發(fā)性HIV病毒耐藥：指那些直接影響抗病毒藥物作用靶點(diǎn)的變異，具有藥物特異性，可降低抗病毒藥物敏感性 繼發(fā)性變異又稱為補(bǔ)償變異：常出現(xiàn)于原發(fā)性變異已存在的病毒基因組中，原發(fā)性變異可造成復(fù)制關(guān)鍵酶的改變，導(dǎo)致病毒動(dòng)力學(xué)的不利，繼發(fā)性變異可糾正由原發(fā)性變異導(dǎo)致的不利，提高病毒的耐藥性，對(duì)原發(fā)性變異起到保護(hù)和促進(jìn)作用,HIV抗病毒治療的耐藥監(jiān)測,37,,耐藥性檢測有兩種方法 表型檢測：通過用藥期間的病毒培養(yǎng)進(jìn)行 基因型檢測：通過分子生物學(xué)方法檢測與耐藥性相關(guān)的病毒基因突變 基因型檢測的費(fèi)用較低，較容易，可在樣品收集后1～2周得到結(jié)果，但分析基因型耐藥檢測時(shí)，需要掌握大量相關(guān)知識(shí)，如突變與抗病毒藥物及其它藥物的交叉耐藥等，才能對(duì)結(jié)果進(jìn)行正確的分析。表型檢測可以直接檢測病毒的耐藥性，但操作復(fù)雜、耗時(shí)，技術(shù)要求高，且非常昂貴，因此目前國際上廣泛應(yīng)用于臨床的是基因型耐藥檢測。,38,人乳頭瘤狀病毒（human papillomavirus, HPV ）,HPV具有宿主和組織特異性，只能感染人的皮膚和黏膜上皮細(xì)胞，人是HPV的惟一宿主。 有100多個(gè)型 低危型：HPV 6、11引起良性病變 (尖銳濕疣、喉乳頭瘤等) 高危型：HPV 16、18引起惡性腫瘤 (宮頸癌、肛門癌、口腔癌等) 新生兒產(chǎn)道感染。 免疫原性低，易形成持續(xù)性感染。,39,高危型 16.18.31.33.35.39.45.51.52.56.58.59. 68.73.82.亞型CP8304 可能高危型 26.66.53 低危型 6.11.40.42.43.44.54.61.70.72.81.cp6108,HPV型別,40,41,HPV中國型別分布,烏蘭娜,吳瑞芳等，人乳頭瘤病毒基因亞型與宮頸病變的關(guān)系,中國婦產(chǎn)科臨床雜志,42,Major capsid protein,Transforming genes/growth stimulation,Minor capsid protein,Regulation of viral replication,Regulation of viral transcription & replication,URR,43,HPV,44,2001年在歐洲由德國、法國和英國聯(lián)合對(duì)二代雜交捕獲HC2 HPV檢測在宮頸癌篩查中的作用進(jìn)行了大規(guī)模的研究和評(píng)估 K.U. Petry, C. Clavel, A. Szarewski, T.Iftner, P.Birembaut, J.Cuzick,,,23,890 (篩查人數(shù)）,,21,409,,HPV- 細(xì)胞學(xué)-,,,,488,HPV- 細(xì)胞學(xué)+,,,1370,HPV+ 細(xì)胞學(xué)-,,,523,,陰道鏡檢查 533無病例 發(fā)現(xiàn),,,,,,,,,,只發(fā)現(xiàn)3 個(gè)病例,發(fā)現(xiàn)59 個(gè)病例,發(fā)現(xiàn)144個(gè)病例,HPV+ 細(xì)胞學(xué)+,,,45,HC2 與巴氏涂片對(duì)檢測CIN2或以上的病變 的敏感度比較,46,各地區(qū)細(xì)胞學(xué)與HPV敏感度結(jié)果比較篩查,47,,“HPV相比其它所有的宮頸癌篩查方法重復(fù)性更好，是值得信賴的、可靠的宮頸癌初篩新方法?！?48,,49,HPV-DNA分型檢測的意義 ： 監(jiān)測子宮頸上皮內(nèi)高度病變 區(qū)分患者患宮頸癌的危險(xiǎn)度 篩查宮頸細(xì)胞低度病變（ASCUS或CINI）中潛在的宮頸癌 高?；颊?用于手術(shù)后追蹤以確定是否將病灶清除干凈 用于治療后的隨訪 指導(dǎo)HPV疫苗的研究及使用 評(píng)估治療療效,,50,EB病毒,1964年名Esptein-Barr 首先發(fā)現(xiàn)、命名 1966年Old等首先證實(shí)EB病毒和鼻咽癌的血清學(xué)關(guān)系 1968年Henle等證明該病毒是傳染性單核細(xì)胞增多癥的病原體,51,EB病毒特異性抗原,病毒潛伏感染時(shí)表達(dá)的抗原： EB病毒核抗原（EBNA） EB病毒潛伏感染膜抗原（EBLMP） 病毒增殖感染相關(guān)抗原： EB病毒特異性抗原EB病毒早期抗原（EA） EB病毒衣殼抗原（VCA） EB病毒膜抗原（MA）,52,53,EBV感染時(shí)主要抗病毒抗體產(chǎn)生的模式,54,SARS冠狀病毒,一種新的烈性呼吸道傳染病。 疾病的病原體（SARS冠狀病毒；SARA-CoV）。 SARS為全身損傷性疾病，尤以肺組織、免疫組織及小靜脈為主。 SARS的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)明確，實(shí)驗(yàn)室的輔助手段是抗-SARA-CoV IgM的檢測和病毒的核酸分析。,55,56,,57,甲型H1N1流感病毒,甲型流感病毒根據(jù)其表面(H和N)結(jié)構(gòu)及其基因特性的不同又可分成許多亞型，至今甲型流感病毒已發(fā)現(xiàn)的血凝素有16個(gè)亞型(H1-H16)，神經(jīng)氨酸酶9個(gè)亞型(N1-N9)。,58,世界衛(wèi)生組織2009年4月30日宣布，從當(dāng)日起，該組織不再使用“豬流感”一詞，而開始使用“A（H1N1）型流感”一詞。與之相對(duì)應(yīng)，我國的官方文件從5月1日起相繼用“甲型H1N1流感”代替原來的“人感染豬流感”。,甲型H1N1流感,59,甲型H1N1流感病毒屬于正粘病毒科，典型病毒顆粒呈球狀，直徑為80 nm~120 nm，有囊膜。囊膜上有許多放射狀排列的突起糖蛋白，分別是血凝素HA、神經(jīng)氨酸酶NA 和M2蛋白。病毒顆粒內(nèi)為核衣殼, 呈螺旋狀對(duì)稱, 直徑為10nm。甲型H1N1流感病毒為單股負(fù)鏈RNA 病毒，基因組約為13.6 kb，由大小不等的8 個(gè)獨(dú)立片段組成。,甲型H1N1流感,60,甲型H1N1流感,61,流行病學(xué)特點(diǎn) 傳染源 主要為病豬和攜帶病毒的豬，感染豬流感病毒的人也被證實(shí)可以傳播病毒。感染這種病毒的動(dòng)物均可傳播。 傳播途徑 主要為呼吸道傳播，也可通過接觸感染的豬或其糞便、周圍污染的環(huán)境或氣溶膠等途徑傳播。某些毒株如H1N1可在人與人之間傳播，其傳染途徑與流感類似，通常是通過感染者咳嗽或打噴嚏等。 易感人群 普遍易感?；颊叨鄶?shù)年齡在25歲至45歲之間，目前報(bào)道以青壯年為主，應(yīng)注意老人和兒童。,甲型H1N1流感,62,實(shí)驗(yàn)室檢查 外周血象：白細(xì)胞總數(shù)一般不高或降低。重癥患者多有白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞減少，并有血小板降低； 血清學(xué)診斷：可使用間接ELISA、抗原捕捉ELISA、熒光免疫法等； 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）：由于PCR技術(shù)具有簡便、快速、靈敏、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，已用于豬流感病毒基因的檢測和分子流行病學(xué)調(diào)查等； 病毒分離：從患者呼吸道標(biāo)本中（咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或氣管吸出物、痰或肺組織）分離甲型H1N1流感病毒。常用的方法有雞胚接種法和細(xì)胞培養(yǎng)法?，F(xiàn)有的診斷方法中，病毒分離法是較敏感的，但需要2-3周時(shí)間。,甲型H1N1流感,63,1957年在加拿大首次報(bào)告，新西蘭Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson從患者糞便和咽拭中分離出CoxA16，同時(shí)患者血清抗體有四倍增長,初步查明CoxA16為本病病原； 1959年提出HFMD命名，HFMD在全球廣泛流行，無明顯的地域分布。 之后世界各地均經(jīng)常發(fā)生由各型柯薩奇、?？刹《竞虴V 71引起的手足口病流行。 發(fā)熱, 不適, 咽喉腫痛, 口腔、手、腳側(cè)面及掌心、屁股出現(xiàn)小泡 傳染性極高 病程約1周,手足口病病毒（Hand, foot and mouth disease Virus ）,64,手足口病可由多種腸道病毒所引起，其中包括 CoxA5,A10, A16, A19, EV71,以及部分埃可病毒和柯薩奇B組病毒, 以CoxA16 和 EV71最為常見 傳播途徑: 糞-口途徑傳播: 唾液與糞便; 呼吸道傳播: 空氣飛沫; 接觸傳播 皰疹液中含大量病毒，皰疹破潰后病毒排出。 HFMD為全球性傳染病，在全球廣泛分布，無明顯的地域分布, 但 近年EV71在東南亞一帶流行, 引起較多的重癥和死亡病例。 在80年代和90年代，中國手足口病的流行主要以 CoxA16為主， 2008年，CoxA16 和EV71 共循環(huán)引起手足口病爆發(fā), EV71在大部分省市為優(yōu)勢病毒。,65,手足口病病毒（Hand, foot and mouth disease Virus ）,66,67,患者年齡分布,手足口病病毒（Hand, foot and mouth disease Virus ）,67,人腸道病毒感染的一般致病機(jī)制,68,,致病特點(diǎn) 隱性感染多見，很少引起腹瀉，嬰幼兒、免疫力低下的成人易感。 病毒在機(jī)體腸道中增殖，很少引起腸道癥狀，是以消化道為原發(fā)灶的全身感染。 不同人腸道病毒可引起相同癥狀，同一種人腸道病毒可引起不同臨床表現(xiàn)。 感染過程中形成病毒血癥。,69,中國HFMD的流行 1981年，我國在上海首次報(bào)道了HFMD病例 1987年在中國分離到CVA16 1995年以來，我國陸續(xù)在武漢、深圳、上海、重慶、山東和安徽等地的HFMD患 者中分離到EV71病毒。 2007年，山東發(fā)生了手足口病爆發(fā)流行，累計(jì)報(bào)告HFMD病例39，606例，其中 14例病例死亡。實(shí)驗(yàn)室檢測發(fā)現(xiàn)EV71是引起山東臨沂HFMD的主要病原，同時(shí) 還檢測到Echo3 和/或 CVA16。 2008年全國出現(xiàn)HFMD爆發(fā)流行,以HEV71為優(yōu)勢,CVA16還有其它EV共循環(huán)引 起,70,重癥患者腸病毒的血清型,,,→,71,2009年手足口病疫情部分統(tǒng)計(jì),感染近100萬，手足口病仍然在摧殘者祖國花朵的健康，預(yù)防治療刻不容緩??！,72,1999-2008 五月間共有1232 EV病例為重癥病例，平均死亡率為 13.96%。 EV71為重癥病例中分離頻率最高的血清型。CB3次之。 CA16/EV71/CA4/CA10/CB3/CA6是最常見的血清型。 主要流行高峰在5-7月，在9-11月可能會(huì)出現(xiàn)第二個(gè)流行高峰。 在所有的病例中，1-5歲的患者占到了70%左右。,73,手足口病的實(shí)驗(yàn)室檢測 手足口病的診斷一般是通過采集適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本后進(jìn)行基因檢測、抗原檢測、血清學(xué)抗體檢測、病毒分離和病毒鑒定，如果沒有采到合格的臨床標(biāo)本，或無法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測。 很多血清型的腸道病毒能引起手足口病，不同細(xì)胞系對(duì)不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同時(shí)期腸道病毒的流行株也不同。 通常用于腸道病毒分離的細(xì)胞系為RD、HEp-2、Vero等，聯(lián)合使用上述的兩種或更多細(xì)胞有助于分離到更多的腸道病毒。,74,,謝謝,75,