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骨代謝異常的生物化學診斷,教學目標與要求,1. 掌握 鈣、磷、鎂代謝異常與代謝性骨病的關系 骨礦物質的激素調節(jié)與代謝性骨病的關系 血清鈣、磷和鎂的檢測方法 骨鈣素、骨性堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原前肽和Ⅰ型膠原交聯(lián)降解產(chǎn)物在代謝性骨病診斷中的意義,2,2. 熟悉 骨組織的基本組成、成骨作用與鈣化、溶骨作用與脫鈣 甲狀旁腺素、降鈣素和1,25-(OH)2D3的主要生理作用 PTH、CT、維生素D的常用測定方法 3. 了解 PTH、CT及1,25-(OH)2D3的合成與分泌及其調節(jié) 骨形成和吸收標志物的測定方法,教學目標與要求,3,骨組織組成,4,骨組織與體內鈣、磷代謝密切相關。由于多種原因引起骨組織中鈣、磷等礦物質、成骨細胞和/或破骨細胞功能異常，造成骨基質、骨細胞代謝紊亂，使骨組織處于異常的疾病狀態(tài)，總稱為骨代謝疾?。ó惓＃?，包括佝僂病、骨軟化病、骨質疏松癥等。,骨代謝異常（疾?。?5,目　錄,返回總目錄,6,第一節(jié) 鈣磷鎂代謝異常與代謝性骨病,7,1. 血鈣 　　 鈣被稱為 “生命金屬”，占人體體重的1.5%～2.0%，其中99%存在于骨骼和牙齒中。 　　 血漿中的鈣約占機體總鈣的0.1%，稱為血鈣。,一、鈣代謝異常,（一）血鈣與骨代謝,8,血鈣存在形式,9,,人體鈣分布,10,2. 成骨作用（osteogenesis） 骨的生長、修復或重建過程 鈣化（calcification） 成骨過程中，成骨細胞合成和分泌膠原和蛋白多糖等細胞間質成分，形成“類骨質”，繼后將鈣、磷吸收到纖維的孔隙中進行沉淀結晶的過程,11,影響成骨作用（鈣化）的主要因素,① ∝血液及骨組織微環(huán)境中的［Ca］×［P］濃度乘積 ②正常血中存在的焦磷酸鹽等抑制骨鈣化 ③基質中的骨連接素促進羥磷石結晶的形成并規(guī)律排列 ④膠原纖維的成熟和類骨質的正常是骨鹽沉積的基礎 ⑤骨形態(tài)發(fā)生蛋白（ BMPs）與骨的生成相關,12,3. 溶骨作用（osteolysis ） 骨的溶解和消失 ，包括基質的水解和骨鹽的溶解，主要由破骨細胞引起 。 又稱：骨吸收（bone resorption） 脫鈣（decalcification）,13,（二）常見鈣代謝異常,1．高鈣血癥 （hypercalcemia） 概 念：血鈣濃度超過2.75 mmol/L 常見表現(xiàn)：惡心、嘔吐、便秘、嗜睡、神志不清等 病程長時可發(fā)生組織內鈣沉積,14,常見病因： ①原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進 ②甲狀旁腺素異位分泌 ③惡性腫瘤骨轉移 ④維生素D中毒 ⑤其它疾病,,超過90％,15,2．低鈣血癥 （hypocalcemia ） 概 念：血鈣濃度低于2.25 mmol/L 常見表現(xiàn)：手足抽搐、肌痙攣、喉鳴、驚厥等 骨質鈣化障礙包括佝僂病 、骨質軟化等,16,常見病因： ①甲狀旁腺功能低下 ②維生素缺D缺乏 ③慢性腎功能衰竭 ④新生兒低鈣血癥 ⑤長期低鈣飲食或吸收不良等情況,17,二、磷代謝異常,（一）常見磷代謝異常,1．高磷血癥 （hyperphosphatemia ） 概 念：血磷濃度成人大于1.61 mmol/L 兒童大于1.90 mmol/L 常見表現(xiàn)：低鈣血癥、骨質鈣化障礙,18,高磷血癥常見病因： ①甲狀旁腺功能減退 ②維生素D增多癥 ③慢性腎功能不全或衰竭 ④多發(fā)性骨髓瘤及某些骨病 ⑤新生兒生理狀況下血鈣較成人低，而血磷明顯高于成人,19,2．低磷血癥 （hypophosphatemia） 概 念：血磷濃度小于0.8 mmol/L 常見表現(xiàn)：鴨態(tài)步、骨痛、佝僂病、病理性骨折、 精神錯亂、抽搐和昏迷等,20,低磷血癥常見病因： ①甲狀旁腺功能亢進 ②佝僂病或骨軟化癥 ③糖利用增加 ④乳糜瀉 ⑤肝硬化和腎臟疾病 ⑥使用雌激素、避孕藥和苯巴比妥等藥物,21,（二）低磷血癥與代謝性骨病,1. 低磷性佝僂病和骨軟化癥 血磷顯著降低，并有明顯的肌無力 病人下肢無力，步態(tài)蹣跚或呈鴨態(tài)步,2. X連鎖家族性低磷血癥 又稱遺傳性低血磷性維生素D抵抗性佝僂病 病因：腎小管對磷的重吸收障礙；腸道對磷的吸收減少 后果：血磷降低而引起佝僂病的骨改變,22,三、鎂代謝異常,（一）常見鎂代謝異常,1．低鎂血癥 （hypomagnesemia） 概 念：血清鎂低于0.75 mmol/L 常見表現(xiàn)：神經(jīng)-肌肉障礙和精神與行動的異常,23,①消化道吸收障礙 ②尿路丟失增多 ③內分泌疾病 ④其它疾病,低鎂血癥常見病因,24,2．高鎂血癥 （hypermagnesemia） 概 念：血清鎂高于1.25 mmol/L 常見病因：①腎臟疾病 ②內分泌疾病 ③其它疾病,25,（二）鎂代謝異常與代謝性骨病,大鼠實驗表明，低鎂幼鼠的鈣化骨減少、發(fā)生多種骨骼畸形,高鎂可影響成骨作用，發(fā)生骨營養(yǎng)不良,返回章目錄,26,第二節(jié) 　激素調節(jié)與代謝性骨病,27,一、甲狀旁腺素 （parathormone，PTH）,（一）甲狀旁腺素合成及分泌,甲狀旁腺主細胞,前甲狀旁腺素原 115aa,甲狀旁 腺素原 90aa,PTH 84aa,,,,28,（二）PTH的生理作用：升高血鈣、降低血磷,1. 對骨的作用 動員骨鈣入血，使血鈣升高 增加骨吸收和骨生成，骨吸收大于骨生成 2. 對腎的作用,鈣重吸收,,磷重吸收,,,,保鈣排磷,29,3. 對小腸的作用,PTH,,激活腎臟1α-羥化酶,,活性D3 增加,腸道吸收鈣增加,,,,30,（三）甲狀旁腺功能異常與代謝性骨病,輕型的原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進患者 中重型原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進患者 典型骨病變：纖維性囊性骨炎（棕色瘤）,31,二、降鈣素（calcitonin，CT）,（一）降鈣素的合成與分泌,甲狀腺濾泡旁細胞合成和分泌 單鏈多肽，由32個氨基酸殘基組成 血鈣是影響CT分泌的主要因素,32,抑制破骨、促進成骨 抑制腎小管對鈣、磷的重吸收 抑制腎維生素D-1α-羥化酶活性 因雌激素減少而減少,（二）降鈣素的生理作用 　　　降低血鈣、降低血磷 　其主要作用機制為：,33,三、活性維生素D,（一）活性維生素D的生成,34,（二）活性維生素D的生理作用：升高血鈣、升高血磷,基本途徑,活性維生素D,靶細胞上維生素D受體,激素－受體復合物,二聚體,維生素D反應元件,相關基因的轉錄和翻譯,鈣磷代謝調控,,,視黃醛X受體,,,,,,35,1. 對小腸的作用：促進小腸對鈣磷的吸收和轉運,小腸粘膜上皮細胞維生素D受體,活性維生素D,,相關基因的轉錄和翻譯,鈣結合蛋白表達上調,Ca2+-Mg2+ ATP酶增加,,,,,,,小腸鈣轉運增加,36,2. 對骨的作用：溶骨和成骨的雙重作用,活性維生素D,增加破骨細胞數(shù)量和活性,協(xié)同PTH增加破骨細胞數(shù)量,增加血鈣,增加膠原,,,,促進溶骨 （低血鈣時）,促進成骨 （高血鈣時）,,,3. 對腎臟的作用：促進腎小管對鈣、磷的重吸收,37,（三）維生素D缺乏與代謝性骨病,1．佝僂病和骨軟化癥,活性維生素D缺乏,兒童,成人,骨質軟化癥,佝僂病,,,,,38,2．肝性佝僂病,肝功能障礙,25-羥化酶下降,25-羥化酶,活性維生素D缺乏,膽道阻塞鈣皂形成,維生素D吸收障礙,維生素D缺乏,佝僂病癥狀,,,,,,,39,3．腎性佝僂病、腎性骨營養(yǎng)不良 （renal?osteodystrophy）,40,4.維生素D依賴性佝僂?。╲itamin D depedent rickets，VDDR）又稱假性維生素D缺乏癥。其特點為：,腎小管上皮細胞1-α-羥化酶先天性缺陷 常染色體隱形遺傳 維生素D缺乏癥狀典型，發(fā)病早 大劑量活性維生素D治療可使疾病緩解,41,5.維生素D抵抗（vitamin D resistance）,機體對正常劑量甚至大劑量的維生素D或1,25-(OH)2D3的低反應或無反應現(xiàn)象,其特點為： 維生素D受體基因突變：常染色體隱性遺傳 　常見的有三個主要位點：Q259E、G319V和R73X 臨床上具有典型的佝僂病癥狀和體征 約50%的患者對任何形式的維生素D治療無效,42,鈣磷代謝的激素調節(jié),43,包括雌激素和雄激素，對處于生長階段的個體骨骼發(fā)育和成熟十分重要。 雌激素對1,25-(OH)2D3的合成、降鈣素和PTH分泌均有重要的調節(jié)作用。 雄性激素能促進蛋白質和骨基質的合成，促進肌肉和骨骼生長。 國內外報道中老年人骨礦物質丟失速度與血清性激素含量呈負相關。,四、性激素,44,定義：骨質疏松癥是一種全身性的骨量減少，以骨組織顯微結構退化為特征，并引起骨脆性增加、骨強度降低的疾病。此時骨礦物質和骨基質等比例減少，基本特點在于單位體積內骨組織量減少。 分類： 原發(fā)性 繼發(fā)性（其中退行性骨質疏松癥發(fā)病率最高 ）,骨質疏松癥,45,退行性骨質疏松癥的分型,Ⅰ型骨質疏松癥（絕經(jīng)后骨質疏松癥）,Ⅱ型骨質疏松癥（老年性骨質疏松癥）,,46,（一）Ⅰ型骨質疏松癥,基本原因是雌激素分泌不足 破骨細胞過于活躍，骨轉換增加 骨礦含量減少，導致骨質疏松 表現(xiàn)為單位體積內的骨量減少 血液生化指標基本正常 但骨形成和骨吸收的指標有增高,47,（二）Ⅱ型骨質疏松癥,中老年人骨的吸收大于骨形成，導致骨質疏松 細胞學基礎：破骨細胞的吸收增加 成骨細胞功能衰減 主要由于老年人身體各機能退化而致 骨形成與骨吸收的生化指標均有降低傾向,返回章目錄,48,第三節(jié) 血清鈣磷鎂的測定,49,一、血清鈣的測定,（一）血清鈣測定方法概述——總鈣測定,標 本：血清或低濃度肝素抗凝血漿 測定方法：滴定法、比色法、火焰光度法、 原子吸收分光光度法、同位素稀釋質譜法等 決定性方法：同位素稀釋-質譜法 （IFCC） 參考方法：原子吸收分光光度法 （IFCC） 常規(guī)方法：鄰甲酚酞絡合酮（O-CPC）法 （衛(wèi)生部）,50,（二）血清鈣測定方法概述——離子鈣測定,標 本： 血清、低濃度肝素抗凝血漿或全血 測定方法：生物學法、透析法、超濾法、 金屬指示劑法、ISE法等 參考方法： ISE法,51,（三）血清鈣測定——總鈣測定——O-CPC 法,1. 測定原理,2. 方法評價,操作簡便、快速、穩(wěn)定，同時適于手工和自動化分析 反應體系的pH值對結果影響較大,52,（四）血清鈣測定——離子鈣測定——ISE 法,1. 測定原理,Nernst方程式：在一定條件下，ISE的電位與溶液中的被測離子濃度的對數(shù)成正比,2. 方法評價,操作簡便、快速、重復性好 準確度和敏感性高，影響因素少,53,二、血清磷的測定,（一）血清磷測定方法概述,標 本：血清、肝素化血漿 常用方法：磷鉬酸還原法、磷鉬酸紫外分光光度法、酶法、原子吸收分光光度法、同位素稀釋質譜法等 決定性方法：同位素稀釋質譜法 常規(guī)方法：磷鉬酸紫外分光光度法、磷鉬酸還原法,54,（二）血清磷測定——磷鉬酸還原法,1. 測定原理,2. 方法評價,方法簡便、快速，穩(wěn)定 體系中加入Triton X-100等表面活性劑，則不需要除蛋白即可直接測定,55,（三）血清磷測定——酶法,1. 測定原理,2. 方法評價,血清磷測定的發(fā)展方向 顯色穩(wěn)定，線性范圍寬，干擾因素小，可用于自動化分析 所用的酶試劑比較貴,56,三、血清鎂的測定,（一）血清鎂測定方法概述,標 本：血清（ 非鈣離子絡合抗凝劑） 測定方法：比色法、原子吸收分光光度法、酶法、 同位素稀釋質譜法等 決定性方法：同位素稀釋質譜法 參考方法：原子吸收分光光度法 常規(guī)方法：甲基麝香草酚藍（MTB）比色法 Calmagite染料結合法,57,（二）血清鎂測定——比色法,1. 測定原理,2. 方法評價,方法簡單、實用，可用于自動化分析 采血后應盡快分離血清，而且避免溶血,EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸,EGTA：乙二醇二乙醚二胺四乙酸,58,（三）血清鎂測定——酶法,1. 測定原理,異檸檬酸,α-酮戊二酸,NADP+,NADPH （340nm處吸光度下降）,,鎂離子，ICD,,2. 方法評價,成本低廉、影響因素小，線性范圍寬 試劑穩(wěn)定性欠佳，4℃下只能保存2周左右,返回章目錄,59,第四節(jié) 骨代謝異常的生物化學測定,60,一、骨代謝調節(jié)激素的測定,（一）甲狀旁腺素的測定,1. 測定方法概述 存在形式：PTH-N、PTH-C和PTH-M 測定形式：PTH-C、PTH-M和完整PTH 主要方法： RIA、IRMA、ELISA、ICMA等 國外采用IRMA法和ICMA法測定完整的PTH分子 國內應用最普遍的是RIA法,61,IRMA：免疫放射法 　ICMA：免疫化學發(fā)光法 2. RIA法測定PTH 測定對象：PTH-M和PTH-C 方法類型：競爭性RIA法 125I 標記PTH-M和PTH-C 125I標記的PTH-M和PTH-C與病人樣本中的PTH- M和PTH-C競爭抗體結合位點。,62,（二）維生素D的測定,1. 測定方法概述 25-(OH)D3是反映機體維生素D營養(yǎng)狀態(tài)的理想指標 1,25-(OH)2D3更適合用受體結合法進行分析 25-(OH)D3的測定方法：RIA-CPB和HPLC等 1,25-(OH)2D3的測定方法：RIA、RRA、生物學方法等 以RRA和RIA最為普遍,RIA-CPB：放免－競爭性蛋白結合法 RRA：放射受體法,63,2. 25-(OH)D3的測定 目前主要采用RIA法 佝僂病大鼠血清中維生素D結合蛋白為特異性的結合物 基本流程：①有機溶劑提取血清 ②與放射性標記物競爭與維生素D結合蛋白結合 ③反應平衡后分離游離型和結合型標記物 ④液閃計數(shù)、計算濃度 評價： ①方法簡便，結合蛋白較穩(wěn)定 ②測定前都需要對25-(OH)D3提取純化,64,3. 1,25-(OH)2D3的測定 （1）RRA 采用維生素D缺乏或正常的雞腸道維生素D受體 采用Sep-Pak色譜柱代替高效液相色譜的純化步驟 （2）RIA 采用佝僂病大鼠血清中維生素D結合蛋白作為特異性的結合物，比受體更穩(wěn)定，更方便,65,（三）降鈣素的測定,1. 生物分析法：降血鈣效應分析 2. 放射免疫分析法：樣品CT、放射性標記CT競爭性地與CT特異性抗體結合 3. 夾心放射免疫分析：快速、靈敏、特異,66,二、骨形成標志物的測定,（一）骨鈣素（osteocalcin, OC）的測定,又稱骨γ-羧基谷氨酸蛋白（BGP） 由成骨細胞合成和分泌的一種活性多肽 主要生理功能是維持骨的正常礦化速率 血骨鈣素是反映骨代謝狀態(tài)的一個特異和靈敏的生化指標 測定BGP的方法應用最多的是放射免疫法和酶聯(lián)免疫法,67,（二）骨性堿性磷酸酶（B-ALP）測定,ALP是在堿性條件下催化磷酸酯水解的酶類 B-ALP來自成骨細胞，是骨形成的特異性標志物 血清B-ALP測定方法： 總體分為電泳法和非電泳法 應用較多的方法是放射免疫法 HPLC是目前B-ALP測定分辨率最高的方法,68,B-ALP增高常見于：①甲狀腺、甲狀旁腺功能亢進 ②惡性腫瘤骨轉移 ③佝僂病、骨軟化病 ④骨折和絕經(jīng)后骨質疏松癥等 B-ALP測定意義： ①骨病早期診斷骨病 ②療效的評價和預后的判斷 ③骨轉移癌的病程和治療效果的監(jiān)測,69,Ⅰ型膠原前肽是膠原的延伸段 多檢測Ⅰ型前膠原羧基前肽(PICP)來評價骨形成 PICP的檢測大多采用RIA和電化學發(fā)光免疫分析（ECL） 血清中Ⅰ型膠原前肽水平在一定范圍內是反映成骨細胞活動和骨形成以及反映Ⅰ型膠原合成速率的特異指標,（三）Ⅰ型膠原前肽測定,70,三、骨吸收標志物的測定,HOP是體內膠原代謝的終產(chǎn)物之一 尿HOP排出量可以反映骨吸收和骨轉換程度 尿HOP增高見于：兒童生長期、甲狀旁腺功能亢進 骨轉移癌、慢性腎功能不全 畸形性骨炎、佝僂病和軟骨病 高轉換的骨質疏松患者 尿HOP指標特異性較差，也缺乏靈敏性 尿HOP測定方法：分光光度法 離子交換色譜法和反相HPLC法,（一）尿羥脯氨酸（hydroxyproline, HOP）,71,吡啶酚，脫氧吡啶酚 Ⅰ型膠原降解產(chǎn)物　 Ⅰ型膠原交聯(lián)N末端肽 Ⅰ型膠原交聯(lián)C末端肽 Ⅰ型膠原降解產(chǎn)物是反映骨吸收和骨轉換的良好指標,（二）Ⅰ型膠原交聯(lián)降解產(chǎn)物測定,,72,脫氧吡啶酚（D-Pyr）和吡啶酚（Pyr）是Ⅰ型膠原分子之間構成膠原纖維的交聯(lián)物 尿中Pyr和D-Pyr濃度是反映骨膠原降解和骨吸收的最靈敏和特異的生化指標之一 尿中D-Pyr的含量通常用尿肌酐來校正 常用方法：HPLC-熒光檢測法、競爭性酶免疫法,73,Ⅰ型膠原交聯(lián)C末端肽（CTX）和Ⅰ型膠原交聯(lián)N末端肽（NTX）均是Ⅰ型膠原分解的產(chǎn)物。 血清CTX水平是破骨細胞膠原降解的靈敏指標： ①與骨形態(tài)計量學骨吸收參數(shù)呈顯著正相關 ②與其它骨吸收生化指標如Pyr和D-Pyr呈正相關 常用ELISA法測定,74,TRAP主要存在于破骨細胞 血TRAP水平主要反映破骨細胞活性和骨吸收狀態(tài) 血漿TRAP增高見于： 原發(fā)性甲狀旁腺機能亢進、慢性腎功能不全、畸形性骨炎 骨轉移癌、卵巢切除術后、高轉換率的骨質疏松等 血漿TRAP降低見于： 骨吸收降低的疾病，如甲狀旁腺功能降低 TRAP活性測定方法：免疫法 （缺少特異性識別骨TRAP的檢測方法）,（三）抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）,返回章目錄,75,1.骨組織包括細胞和細胞間質兩部分，前者主要有骨細胞、成骨細胞和破骨細胞三類，后者包括鈣、磷、鎂、鉀、鈉和錳等無機成分和膠原、非膠原蛋白、蛋白多糖和脂質組成的有機成分。,2.鈣、磷、鎂以及骨組織的正常代謝受多種激素的嚴密調控，包括PTH、CT、活性維生素D3和性激素等。PTH由甲狀旁腺合成和分泌，升高血鈣、降低血磷；降鈣素降低血鈣、降低血磷；活性維生素D3升高血鈣、升高血磷。,【小結】,76,3.測定血清礦物質以及相關激素的水平對于代謝性骨病的診斷、鑒別診斷等有重要的意義，包括血鈣測定、血磷測定、血鎂測定以及血清中PTH、CT、維生素D及其代謝產(chǎn)物、骨鈣素和骨性堿性磷酸酶等物質的測定。,【小結】,77,骨代謝異常生化診斷方面目前的進展主要在于： ①開發(fā)靈敏度、特異性更高、操作更簡便的測定方法用于更方便、更準確地測定這些物質成分。 ②探索骨代謝疾病新的生化標志物并確定其參考范圍、臨床意義。,【展望】,78,返回章目錄,謝謝大家！,