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.,基因工程原理,Principle of Gene Engineering,第一章,.,.,,基因研究的發(fā)展階段：,染色體遺傳學,分子生物學,反向生物學,50s,70s,染色體水平,DNA水平,DNA重組,1909年，丹麥W. Johannsen，Gene專業(yè)名詞誕生，“給予生命”,1857－1864：孟德爾碗豆雜交試驗（遺傳因子的獨立分配規(guī)律） 1910年：摩爾根果蠅遺傳學研究 （遺傳的染色體理論）,,1944年：Avery細菌轉化實驗（基因的化學本質是DNA） 1953年：Watson-Crick DNA雙螺旋模型,.,.,,,,,.,.,,學習內容,概論 DNA重組（限制性內切酶） 運輸工具——基因克隆載體 目的基因的制備 目的基因導入受體細胞 外源基因的表達 基因工程的應用,.,.,,基本要求,掌握基因克隆的基本工具，特別是不同的載體。 克隆基因的基本方法。 怎樣利用基因重組技術研究基因的結構、表達和調控。 利用基因工程生產重組蛋白，基因工程在醫(yī)藥和農業(yè)上的應用。 能夠設計一個基因克隆的程序。 PCR技術基本原理和應用 能夠根據酶切結果判讀酶切圖譜，以及判讀DNA序列的能力。,.,.,《基因工程》，龍敏南 等著，科學出版社，普通高等教育“十一五”國家級規(guī)劃教材,.,.,,參考書,Gene cloning, T.A. Brown. Third edition. 基因工程原理，吳乃虎編著，科學出版社 基因工程概論，張惠展編著，華東理工大學出版社。 植物基因工程原理與技術，王關林，方宏筠主編，科學出版社。 分子克隆實驗指南，J. Sambtook, EF Frish, T Maniatis, 金冬雁，黎孟楓等譯，科學出版社。,,.,.,第一章 緒論——基因工程概況,1.1引言 1.1.1基因工程含義 ——指在體外將核酸分子插入病毒、質?；蚱渌d體分子，構成遺傳物質的新組合，并使其摻入到原先沒有這類分子的寄主細胞內，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。 基因工程英文： genetic engineering, gene manipulation, recombinant DNA technique, gene cloning, molecular cloning,.,.,目的基因的制備 DNA重組（限制性內切酶） 運輸工具——基因克隆載體 目的基因導入受體細胞 外源基因的表達,基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質?；蚱渌d體分子，構成遺傳物質的新組合，并使其摻入到原先沒有這類分子的寄主細胞內，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。,關鍵要素：,.,.,1.1.2 基因工程理論依據,基因具有相同的物質基礎：DNA 基因可切割 基因可轉移 多肽——基因 遺傳密碼通用性：三聯密碼 基因遺傳,.,.,1.1.3 基因工程研究的基本路線,基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其它載體分子，構成遺傳物質的新組合，并使其摻入到原先沒有這類分子的寄主細胞內，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。,.,.,1.1.4基因工程發(fā)展史 （1）理論上的三大發(fā)現：,1944, Avery的肺炎雙球菌實驗,確定了遺傳的物質基礎是DNA。 DNA的分子結構及復制機理：50年代，Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結構模型和半保留復制的機理。 1958，Crick提出“中心法則”；1961年，Jacob和Monod “操縱子學說” DNA——RNA-——蛋白質 闡明了遺傳物質的流向和表達問題。,,.,.,.,.,1.1.4基因工程發(fā)展史 （1）理論上的三大發(fā)現：,1944, Avery的肺炎雙球菌實驗,確定了遺傳的物質基礎是DNA。 DNA的分子結構及復制機理：50年代，Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結構模型和半保留復制的機理。 1958，Crick提出“中心法則”；1961年，Jacob和Monod “操縱子學說” DNA——RNA-——蛋白質 闡明了遺傳物質的流向和表達問題。,,.,.,.,.,1.1.4基因工程發(fā)展史 （1）理論上的三大發(fā)現：,1944, Avery的肺炎雙球菌實驗,確定了遺傳的物質基礎是DNA。 DNA的分子結構及復制機理：50年代，Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結構模型和半保留復制的機理。 1958，Crick提出“中心法則”；1961年，Jacob和Monod “操縱子學說” DNA——RNA-——蛋白質 闡明了遺傳物質的流向和表達問題。,,.,.,.,.,DNA分子的體外切割與連接技術1970年，Smith等在流感嗜血桿菌中分離純化了核酸限制性內切酶HindⅢ；1972年，EcoR Ⅰ。 DNA分子的核苷酸序列分析技術 基因工程載體pBR322和pUC13等載體。 Cohen發(fā)現質粒pSC101，并作為基因工程的載體使用.,（2）技術上的三大發(fā)明：,.,.,（3）基因工程的誕生,1972年,美國斯坦福大學的 P.Berg 第一次實現了DNA 體外重組。,.,.,1973年，Cohen等獲得了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落TcrNer，標志著基因工程的誕生：,.,.,Cohen體外重組實驗的意義：,1. pSC101質?？梢宰鳛榛蚩寺〉妮d體. 2. 能夠將外源DNA導入寄主細胞. 3. 質粒-大腸桿菌是一種成功的基因克隆體系.,,.,.,1977年，E. coli中合成了人生長激素基因。 1978-1979胰島素基因在大腸桿菌中表達。 1982年，培育出了超級鼠。 1985年Horsch發(fā)明了植物基因工程的基本方法：葉圓盤法，并獲得轉基因植株。 1990年，患有遺傳免疫疾病的4歲女孩接受了基因療法。 1990年，Perlak 將B.T.基因導入棉花獲得抗蟲棉 。 1991年，美國開始人類基因組計劃。 1997年，“多利”綿羊誕生。,（4） 發(fā)展過程中的重大事件,.,.,轉移大鼠生長素基因的小鼠,.,.,.,.,1.2 基因工程研究內容,目的基因分離 制備重組DNA分子 重組DNA分子轉移到適當的受體細胞 篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞克隆 提取已擴增的目的基因 目的基因克隆到表達載體上，表達，產生目標產物,.,.,.,.,第一次課結束,.,.,瓊脂糖凝膠電泳(0.2-50kb DNA)聚丙烯酰胺凝膠電泳(1-1000bp DNA),1.3 基因操作的基本技術,（1）凝膠電泳：一種分子放置在電場中,會以一定的速度移向適當的電極。,凝膠的分辨能力: 凝膠的類型和凝膠的濃度有關 凝膠電泳的作用: 分析,制備和純化 溴化乙錠:簡稱EB.,,.,.,,,.,.,EB的工作原理：,溴化乙啶,.,.,,-,+,電泳方向,EB分辨率：,0.05μg/帶,.,.,原理:帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合，互補區(qū)段會退火形成雙鏈結構。,（2）核酸的分子雜交 1968年華盛頓卡內基學院 Roy Britten等,常見的分子雜交：,.,.,Southern Blotting雜交:,——1975年，英國人Southern創(chuàng)建，是研究DNA圖譜的基本技術。,.,.,Southern印跡雜交顯色圖片,用途：確定DNA 大小，鑒定DNA轉化結果。,.,.,Northern Blotting雜交:1979年，J.C.Alwine等，應用于特定性狀基因在mRNA水平上的動態(tài)表達研究。。,流程：RNA混合物進行瓊脂糖凝膠電泳→分離得到的RNA轉膜→與放射性標記的探針雜交 →結果分析,.,.,（3）細菌的轉化（Transformation）,——一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA，而導致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生命過程。,.,.,雙脫氧鏈終止法（Sanger法）：英國生物化學家Frederick Sanger于1977年發(fā)明,（4）DNA核苷酸序列分析,,,模板 標記的引物 DNA聚合酶 dNTP 雙脫氧鏈終止物ddNTP,,反應組成,檢測方法：電泳 放射自顯影讀出DNA序列長度：250bp,.,.,,.,.,DNA Sequencing via the Sanger Method,模板 標記的引物 DNA聚合酶 dNTP 雙脫氧鏈終止物ddNTP,.,.,Frederick Sanger,1918年8月13日－2013年11月19日，英國生物化學家。 是第四位兩度獲得諾貝爾獎，以及唯一獲得兩次化學獎的人。,1958年：確定胰島素結構，獲得諾貝爾化學獎 1980年：發(fā)明Sanger測序法，再諾貝爾化學獎,.,.,化學降解法(Maxam-Gilbert法）：250bp 1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert建立的DNA片段序列的測定方法,.,.,DNA分子末端放射性標記,電泳,四個獨立的降解體系,放射自顯影,G反應：G甲基化（硫酸二甲酯） G+A反應：A和G質子化（甲酸） T+C反應：T和C嘧啶環(huán)斷裂（肼） C反應：C嘧啶環(huán)斷裂（高鹽、肼）,,,,,,.,.,DNA序列分析儀,.,.,聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR ） 1985年，美國，Mullis：體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。成果發(fā)表在Science上。,（5）基因擴增（gene amplification）,1993年因發(fā)明PCR技術，與邁克爾·史密斯分享諾貝爾化學獎,Kary Banks Mullis，1944年12月28日－,“我感謝諾貝爾評獎委員會,在我還能夠盡情享受生活的年齡及時地把諾貝爾獎授予給我.”,“Fish don’t know much about water, and people didn’t know much about air.” “Play! Experiment! Discover!”,.,.,.,.,基本原理：,.,.,.,.,.,.,1.4 基因克隆需要特殊的工具和技術,運輸工具： 細菌質粒 病毒染色體 DNA操作技術 純化DNA 剪切DNA分子 分析DNA片段大小連接DNA分子 將DNA轉入受體細胞重組子的鑒定,,,.,.,1.5 基因工程的意義,大規(guī)模的生產生物分子 設計構建新物種 搜尋、分離和鑒定生物體尤其是人體內的遺傳信息。,.,.,醫(yī)藥 重組藥物 基因治療 檢測遺傳疾病、病原 農業(yè) 抗病蟲 提高品質 提高花卉的觀賞價值 抗逆性 家畜：瘦肉比；飼料利用率；加快生長,.,.,主要基因工程產品的研制、開發(fā)、上市時間,.,.,.,,謝謝聆聽,2018/7/21,53,