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單克隆抗體的應(yīng)用前景及進(jìn)展,1,動(dòng)物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，具有不同基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個(gè)具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）和記憶B細(xì)胞，大量的漿細(xì)胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。如果能選出一個(gè)制造一種專一抗體的漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。,概念？,特定抗原,一種B細(xì)胞,特異性抗體,,,刺激,產(chǎn)生,2,雜交瘤細(xì)胞,挑選出一個(gè)產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞在體外持久培養(yǎng)進(jìn)行克隆增殖，便可同時(shí)得到大量均一的單克隆抗體。但是抗體形成細(xì)胞在體外持久培養(yǎng)困難，如脾細(xì)胞體外培養(yǎng)一般一周內(nèi)死亡?？墒菒盒阅[瘤細(xì)胞的特點(diǎn)之一是在體外培養(yǎng)中可無限期地增殖。用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，使抗體形成細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞雜交，得到的雜交瘤細(xì)胞。這種細(xì)胞保持了親代細(xì)胞雙方的特性，既具有腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)中可以無限期地增殖的特性，又具有抗體形成細(xì)胞的不斷分泌特異性抗體的特性。,3,典型例子,4,優(yōu)點(diǎn),——和常規(guī)抗血清相比,1.特異性強(qiáng)：?jiǎn)慰寺】贵w是針對(duì)抗原分子表面抗原決定簇的，有人陳為“單特異性”。它是研究生物大分子和細(xì)胞表面細(xì)微結(jié)構(gòu)以及診斷治療疾病的有力工具。2.可大量生產(chǎn)，容易標(biāo)準(zhǔn)化：一旦獲得1株雜交瘤細(xì)胞株，就可以無限制地反復(fù)制備出相同特異性的單克隆抗體。由于來自同一株細(xì)胞，很容易標(biāo)準(zhǔn)化。3.用不純的抗原，可以制備出純的單克隆抗體。用這種抗體又可以提純抗原。因?yàn)榫哂猩鲜鎏攸c(diǎn)，單克隆抗體應(yīng)用范圍很廣，幾乎滲透到生物醫(yī)學(xué)的每一個(gè)領(lǐng)域，在生物醫(yī)學(xué)研究，臨床醫(yī)學(xué)，軍事醫(yī)學(xué)和工業(yè)生產(chǎn)上都有重要的實(shí)用意義。,5,單克隆抗體，簡(jiǎn)稱單抗藥物，有“生物導(dǎo)彈”之稱，目前是生物制藥產(chǎn)業(yè)中最大類別的產(chǎn)品，也是生物制藥產(chǎn)業(yè)中增長(zhǎng)最快的領(lǐng)域之一。全球領(lǐng)先的醫(yī)藥健康咨詢服務(wù)公司IMSHealth數(shù)據(jù)顯示，2009年全球15大暢銷藥品中，抗體藥物占據(jù)了1/3。業(yè)內(nèi)人士普遍認(rèn)為，單克隆抗體藥物是中國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿ψ顬榫薮蟮男滤幏较颉?前景：,6,7,應(yīng)用前景,單克隆抗體能與其相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合，因而能夠從復(fù)雜系統(tǒng)中識(shí)別出單個(gè)成分。只要得到針對(duì)某一成分的單克隆抗體，利用它作為配體，固定在層析柱上，通過親合層析，即可從復(fù)雜的混和物中分離、純化這一特定成分。例子：用抗人絨毛膜促性腺激素(hCG)親合層析柱，就可從孕婦尿中提取到純的hCG。與其它提取方法(沉淀法、高效疏水色譜法等)相比，具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、產(chǎn)品活性高等優(yōu)點(diǎn)。,1 作為親合層析的配體,8,,2 作為生物治療的導(dǎo)向武器 包有細(xì)胞毒劑的脂質(zhì)體膜上偶聯(lián)抗體，可定向攻擊靶細(xì)胞。這種“導(dǎo)向治療”，在動(dòng)物試驗(yàn)與體外試驗(yàn)中已獲得滿意效果。例子：熱敏免疫脂質(zhì)體，由抗人乳癌細(xì)胞抗體經(jīng)疏水長(zhǎng)鏈脂肪酸修飾，抗體帶上長(zhǎng)的疏水碳鏈，部分插入脂質(zhì)體的脂雙層膜中，抗體Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗體活性。熱敏免疫脂質(zhì)體可特異識(shí)別靶細(xì)胞(人乳癌細(xì)胞)，并通過相變溫度引起脂質(zhì)體破裂，從而定向釋放藥物。常見抗腫瘤細(xì)胞毒劑：化療藥物、細(xì) 菌毒素、植物毒素或放射性同位素等。優(yōu)點(diǎn):這不僅提高了抗體的療效，也 可降低細(xì)胞毒劑對(duì)正常細(xì)胞的毒性反應(yīng)。瓶頸：應(yīng)用于臨床，目前還存在不少 技術(shù)難關(guān)，包括人體對(duì)鼠源單抗的排異問 題等。,9,抗人T淋巴細(xì)胞單抗(McAb)作為一種新型免疫抑制劑，已廣泛應(yīng)用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應(yīng)。其作用機(jī)理有賴于McAb的種類及其免疫學(xué)特性。例1：注射抗小鼠Thy-1抗原的單抗，可以抑制小鼠同種皮膚移植的排斥反應(yīng)。例2：對(duì)用于同種骨髓移植的供體骨髓，在體外經(jīng)抗T細(xì)胞單抗加補(bǔ)體處理，能減輕移植物抗宿主病的發(fā)生。,3 作為免疫抑制劑,10,利用單克隆抗體的特性可把它作為研究工作中的探針。此時(shí)，可以從分子、細(xì)胞和器官的不同水平上，研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，進(jìn)而并可從理論上闡明其機(jī)理。例子：用熒光物質(zhì)標(biāo)記單抗作為探針，能方便地確定與其結(jié)合的相應(yīng)生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸、酶等)在細(xì)胞中的位置和分布。 制作生物芯片（即蛋白質(zhì)芯片）以及用于western雜交。,4 作為研究工作中的探針,11,抗體對(duì)抗原免疫原性的增強(qiáng)作用由來已久，60年代就已發(fā)現(xiàn)幼豬對(duì)破傷風(fēng)類毒素難以產(chǎn)生抗體，注射相應(yīng)特異性抗體IgG，就能有效地提高對(duì)委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒的免疫應(yīng)答。1984年以來，Celis等發(fā)現(xiàn)，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增強(qiáng)HBs抗原對(duì)特異性人T細(xì)胞克隆的刺激增殖，并可誘生干擾素。在小鼠中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)蛣┝康腍Bs抗原不產(chǎn)生免疫反應(yīng)時(shí)，加入抗HBs抗體組成的復(fù)合物，則可有效地誘生免疫反應(yīng)。根據(jù)這一作用，現(xiàn)已研制出乙肝的抗原—抗體復(fù)合物型治療性疫苗。,5 增強(qiáng)抗原的免疫原性,注：抗原的免疫原性，首先決定于其自身的化學(xué)特性，但同一種抗原，對(duì)不同種動(dòng)物或同種動(dòng)物不同個(gè)體間其免疫原性強(qiáng)弱，可表現(xiàn)很大差異，因此一種抗原的免疫原性是由其化學(xué)性質(zhì)和宿主因素決定的。,12,單克隆抗體作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)試劑，更能充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)。單克隆抗體的特異性強(qiáng)，大大提高了抗原—抗體反應(yīng)的特異性，減少了和其它物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)的可能性，使試驗(yàn)結(jié)果可信度更大。單抗的均一性和生物活性的單一性，使抗原—抗體區(qū)應(yīng)結(jié)果便于控制，利于標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。目前已有許多檢驗(yàn)試劑盒用單抗制成，其主要用途如下：,6 作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)試劑,(1)診斷各類病原體 這是單抗應(yīng)用最多的領(lǐng)域，已有大量診斷試劑商品供選擇。如用于診斷乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒和各種微生物、寄生蟲感染的試劑等。單抗所具有的靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)，使其在鑒別菌種的型及亞型、病毒變異株，以及寄生蟲不同生活周期的抗原性等方面更具獨(dú)特優(yōu)勢(shì),13,用于腫瘤的診斷、分型及定位。盡管目前尚未制備出腫瘤特異性抗原的單抗，但對(duì)腫瘤相關(guān)抗原(如甲胎蛋白、腫瘤堿性蛋白和癌胚抗原)的單抗早就用于臨床檢驗(yàn)。 隨著淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的應(yīng)用，許多抗人腫瘤標(biāo)記物的雜交瘤細(xì)胞株已經(jīng)建立，這為腫瘤的早期診斷及其闡明腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，了解腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性及其定量研究奠定了基礎(chǔ)。用抗腫瘤單抗檢查病理標(biāo)本，可協(xié)助確定轉(zhuǎn)移腫瘤的原發(fā)部位。以放射性核素標(biāo)記單抗可用于體內(nèi)診斷，再結(jié)合X-線斷層掃描技術(shù)，可對(duì)腫瘤的大小及其轉(zhuǎn)移灶作出定量診斷。,(2)腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原的檢測(cè),14,用于區(qū)分細(xì)胞亞群和細(xì)胞的分化階段。例如檢測(cè)CD系列標(biāo)志，有利于了解細(xì)胞的分化和T細(xì)胞亞群的數(shù)量和質(zhì)量變化，這對(duì)多種疾病診斷具有參考意義。細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)，將對(duì)白血病患者的疾病分期、治療效果、預(yù)后判斷等方面有指導(dǎo)作用。組織相容性抗原檢測(cè)是移植免疫學(xué)的重要內(nèi)容，應(yīng)用單抗對(duì)其進(jìn)行位點(diǎn)檢測(cè)可得到更可信的結(jié)果。,(3)檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志,15,應(yīng)用單抗結(jié)合其它技術(shù)，可對(duì)機(jī)體的多種微量成分進(jìn)行測(cè)定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的靈敏性和抗原-抗體反應(yīng)的特異性而建立起來的方法，它可以測(cè)至10-9～10-12g，使原來難以測(cè)定的激素能夠進(jìn)行定量分析。除了激素，還可檢測(cè)諸多酶類、維生素、藥物和其它生化物質(zhì)。這對(duì)受檢者健康狀態(tài)判斷、疾病檢出、指導(dǎo)診斷和臨床治療均具有實(shí)際意義。,(4)機(jī)體微量成分的測(cè)定,16,單克隆抗體在理論和實(shí)踐上的應(yīng)用成為解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等許多重大問題的重要手段。但是，上述應(yīng)用的單抗屬于鼠源性，鼠源性單抗應(yīng)用于人類有較強(qiáng)的免疫原性，主要缺陷是誘發(fā)人抗鼠抗體（Human anti-mouse antibody,HAMA）反應(yīng)，大大限制了其臨床應(yīng)用價(jià)值。而且，鼠源性抗體在人體內(nèi)半衰期縮短，生物活性降低。因此，人們一直致力于人源性抗體的研究。,瓶頸,17,以分子生物學(xué)技術(shù)提取、擴(kuò)增編碼人抗體的DNA，構(gòu)建質(zhì)粒，建立組合抗體文庫，再利用供者文庫建立針對(duì)某一特定抗原的子文庫。以該技術(shù)制備的抗體片段(Fab)是人源抗體，具有建庫簡(jiǎn)單、抗體表達(dá)穩(wěn)定等特點(diǎn)。迄今已有多種抗體產(chǎn)生?？梢灶A(yù)見，該技術(shù)具有良好的發(fā)展和應(yīng)用前景。,解決方案：,（1）如用人脾細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交；,（2）用EB病毒轉(zhuǎn)化人的B淋巴細(xì)胞；,（3）用基因工程法制備嵌合抗體等。,,困難,（4）最新方法：——噬菌體技術(shù)和轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù),18,人源化治療性單克隆抗體的研究進(jìn)展,構(gòu)建的基本思路,鼠抗體人源化就是通過基因改造，使其和人體內(nèi)的抗體分子具有極其相似的輪廓，從而逃避人免疫系統(tǒng)的識(shí)別，避免誘導(dǎo)HAMA（人抗鼠抗體）反應(yīng)。對(duì)鼠源抗體 進(jìn)行人源化改造時(shí)要遵守兩個(gè)原則，首先要保持抗體的親和力和特異性，其次要降低或消除抗體的免疫原性。,19,單克隆抗體的發(fā)展史,第一代：鼠源性單抗,藥物特異性很強(qiáng)，副作用大，現(xiàn)在已經(jīng)漸漸退出市場(chǎng)。不過由于其代謝比較快，目前在放射性元素標(biāo)記的單克隆抗體藥物中使用。,第二代：人鼠嵌合性單抗,進(jìn)行人源化改造，使其人源化程度達(dá)到70%左右。,第三代：CDR移植抗體和SDR移植抗體,人源化程度達(dá)到95%左右，大大降低了毒副作用。,第四代：全人源化單抗,2002年，的世界首個(gè)藥物——阿達(dá)木單抗上市。人源化及全人源單克隆抗體由于副作用小，在體內(nèi)停留時(shí)間長(zhǎng)，更有利于治療。,20,人源化程度,,,,,21,1.嵌合抗體（Chimeric antibody),用人源基因代替鼠源單抗的恒定區(qū)，即該單抗由鼠的可變區(qū)和人的恒定區(qū)組成的嵌合抗體。,由于嵌合抗體可變區(qū)（V）約占整個(gè)抗體的30%，鼠源性抗體V區(qū)中的框架區(qū)（FR)仍殘留一定的免疫原性，可誘導(dǎo)HAMA反應(yīng)。,靈長(zhǎng)目源抗體也是一類嵌合抗體，通過免疫短尾猿猴產(chǎn)生。由于其抗體的可變區(qū)與人可變區(qū)無差異，不至于發(fā)生抗體反應(yīng)。,缺點(diǎn),解決方案,22,2.CDR移植抗體（CDR grafted antibody),真正意義上的抗體人源化?？贵w中除了3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）是鼠源的外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)，人源化程度可達(dá)到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。,不足,有時(shí)異基因的CDR人源化抗體可能引起抗個(gè)體基因型反應(yīng)。,改良方案,——進(jìn)行SDR移植改良,23,3.SDR移植抗體(SDR grafted antibody),在CDR移植抗體的基礎(chǔ)上，將異源抗體中與抗原結(jié)合密切相關(guān)的SDR等少數(shù)殘基移植到人抗體相應(yīng)位置上，進(jìn)一步降低了抗體的異源性。通過這種方法，使人源化的抗體潛在的免疫原性降至最低。,24,4.全人單克隆抗體（Fully humaneantibody),它是將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨(dú)特的優(yōu)越性。,4.1.抗體庫篩選技術(shù),4.1.1.噬菌體表面展示技術(shù),25,用PCR技術(shù)從人免疫細(xì)胞中擴(kuò)增出整套的抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因，克隆到噬菌體載體上并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面。這樣一來噬菌體DNA中有抗體基因的存在，同時(shí)在其表面又有抗體分子的表達(dá)，就可以方便地利用抗原-抗體特異性結(jié)合而篩選出所需要的抗體，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。使抗體基因以分泌的方式表達(dá)，則可獲得可溶性的抗體片段。,基本原理和程序,26,4.1.2.核糖體展示技術(shù),它將正確折疊的蛋白及其 mRNA同時(shí)結(jié)合在核糖體上， 形成mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體，使目的蛋白的基因型和表型聯(lián)系起來，構(gòu)成核糖體展示的蛋白文庫， 然后用相應(yīng)的抗原從翻譯混合物中進(jìn)行篩選， 以乙二胺四乙酸 （EDTA） 解離結(jié)合的核糖體復(fù)合物或以特異抗原洗脫整個(gè)復(fù)合物，并從中分離 mRNA。通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT- PCR） 提供下一輪展示的模板， 所得 DNA進(jìn)入下一輪富集，部分 DNA可通過克隆進(jìn)行測(cè)序分析等。 利用此技術(shù)可以獲得特異性的、高親和力的抗體。,27,4.2.轉(zhuǎn)基因小鼠,通過基因敲除技術(shù)，使小鼠自身的基因失活，并導(dǎo)入新基因，創(chuàng)造出攜帶人抗體重輕基因簇的轉(zhuǎn)基因小鼠。這種人抗體基因小鼠所攜帶的人DNA片段具有完善的功能，可以有效地進(jìn)行同型轉(zhuǎn)換和親和力成熟。任何靶抗原均可被用來免疫該小鼠，使其產(chǎn)生高親和力的人抗體。,案例：,日本麒麟公司用基因工程技術(shù)，使小鼠攜帶完整的人14號(hào)染色體，該染色體包含全部人抗體產(chǎn)生基因。,但迄今尚無該技術(shù)生產(chǎn)的制品問世。,28,4.3.微胞雜交干細(xì)胞技術(shù),——日本學(xué)者Ishida等首先提出,技術(shù)要點(diǎn)： 首先將抗G418的人成纖維細(xì)胞與小鼠的A9細(xì)胞融合，通過篩選，得到抗G418的小鼠A9細(xì)胞，再運(yùn)用PCR或原位熒光雜交方法篩選，先篩選出的細(xì)胞用秋水仙素處理48h，然后用細(xì)胞松弛素B處理并高速離心，分離出含2號(hào)、14號(hào)、22號(hào)染色體的小鼠。,人源抗體在這種轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)量還比較低。,29,4.4.其他方法,XTL生物制藥公司使用一種類似于人骨髓移植的方法，用放射線破壞動(dòng)物骨髓，然后注入人抗體生成細(xì)胞。該公司已用此法生產(chǎn)出一種全人單抗。,30,31,應(yīng)用單克隆抗體后的患者癥狀改善率,32,總結(jié),到目前為止，至少有35個(gè)完全人類的單抗已經(jīng)進(jìn)入臨床的治療實(shí)驗(yàn)階段。這些單抗的靶抗原都是臨床癌疾病自身免疫疾病或炎癥疾病和傳染病中的主要抗原。例如EGFR/CTLA-4和CD4等。在治療一些一種移植、骨質(zhì)疏松癥等疾病已有顯著的效果。但是，免疫原性仍是存在的問題，因此，利用轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)得到的單抗仍是未來藥物的主流。抗體人源化以及完全人源化抗體的制備已經(jīng)成為當(dāng)今治療性抗體的發(fā)展趨勢(shì)，同時(shí)，各種抗體衍生物免疫原性低、更易通過血管壁到達(dá)病源，通過PEG化等方法可以延長(zhǎng)其半衰期；人抗體是否可以解決鼠抗體運(yùn)用中出現(xiàn)的所有問題，還有待大量臨床試驗(yàn)的檢驗(yàn)。所以可行的方法就是在完善人抗體技術(shù)的同時(shí)，推進(jìn)治療性小分子衍生物的研究，根據(jù)臨床的實(shí)際設(shè)計(jì)靈活有效的治療方案，使人源化抗體和小分子抗體互為補(bǔ)充。,33,Thanks!,34,