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抗體工程制藥 單克隆抗體的制備,1,掌握：單克隆抗體的概念和特點(diǎn)、制備原理，制備方法及基本過程熟悉：單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用了解：單克隆抗體的發(fā)展,2,主要內(nèi)容,,,,3,銀屑病,手口足病,癌癥,亞急性濕疹,沒有單克隆抗體前人類所遇見的問題,4,用于診斷鑒定人的血型類別,用于尋常型銀屑病亞急性濕疹,用于復(fù)發(fā)或耐藥的濾泡性中央型淋巴瘤,犬瘟熱病毒單克隆抗體,單克隆抗體藥物,5,Georges J.F. Kohler,Cesar Milstein,1975年將產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合, 成功建立了單克隆抗體技術(shù)。,1984年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。,一、單克隆抗體技術(shù)發(fā)展,6,,1.概念（1）抗體：是機(jī)體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。,（2）單克隆抗體（monoclonal antibody ）：(簡稱單抗 )，由經(jīng)過特定的抗原處理過的效應(yīng)B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞雜交得到的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的具有特異性識(shí)別某抗原上的某一個(gè)特定抗原決定簇的抗體。,二、單克隆抗體的概念及特點(diǎn),7,2. 單克隆抗體的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) ：（1）理化性狀高度均一、結(jié)構(gòu)、氨基酸順序、特異性等 一致 （2）生物活性單一、靈敏度高 （3）與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法 （4）便于人為處理和質(zhì)量控制，來源容易，可以在體外“永久”地存活并傳代 （5）可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療,8,局限性 ：（1）固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍 （2）反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體 （3）制備技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)工、價(jià)格較高,9,三、單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用,1.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷 （1）病原微生物抗原抗體的檢測：乙肝表面抗原試紙 （2）腫瘤抗原的檢測 （3）免疫細(xì)胞及其亞群的檢測 （4）激素測定：早孕檢測試紙、女性排卵檢測試紙 （5）細(xì)胞因子的測定 （6）其他：嗎啡類毒品檢測試紙等 2.蛋白質(zhì)的提純 3.腫瘤的導(dǎo)向治療和放射免疫顯像技術(shù),10,克隆化過程,四、單克隆抗體制備過程,11,1.致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備 動(dòng)物選擇：品系、年齡、性別、健康狀態(tài) 抗原接種：方式—體內(nèi)、體外劑量—0.5-100?g次數(shù)—視抗原而定間隔—視抗原而定佐劑—視抗原而定 收集時(shí)間：末次接種后72 h2.骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備 細(xì)胞株處于良好的生長狀態(tài) 細(xì)胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)HGPRT：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,12,離心 1000rpm 10 min,50%PEG 1 mL,培養(yǎng)液 10 mL,,,,離心 1000rpm 7min,37 °C搖動(dòng)、由慢漸快1min、靜止1.5min,,加入HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi),3. 細(xì)胞融合,,13,4. HAT選擇性培養(yǎng)HAT是用于篩選具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)或胸苷激酶 (TK)活性缺陷細(xì)胞的培養(yǎng)基。含有次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸。在氨基蝶呤(二氫葉酸類似物)存在下，這種酶缺陷的細(xì)胞不能通過核苷酸合成旁路合成次黃嘌呤和胸苷。HPRT和TK缺陷細(xì)胞可以在此培養(yǎng)基中生存。是常用的骨髓雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基。,14,5. 抗體分泌細(xì)胞的篩選對(duì)篩選方法的要求：多——大量樣品一次檢測；快——迅速取得檢測結(jié)果；準(zhǔn)——檢測結(jié)果可靠性高； 靈——檢測方法靈敏度高。常用篩選方法：ELISA、IFA等,15,6. 克隆化過程方法：有限稀釋法 克隆建立的標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)兩次以上100%陽性孔 飼養(yǎng)細(xì)胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾細(xì)胞,16,,,B淋巴細(xì)胞,注射特定抗原蛋白,骨髓瘤細(xì)胞,培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞,,,,,融合,多種雜交細(xì)胞,,,,,,專一抗體檢驗(yàn)陽性,,克隆上述雜交細(xì)胞,分開不同雜交細(xì)胞，克隆專一抗體，檢驗(yàn)陽性細(xì)胞,,單克隆抗體,注射到小鼠體內(nèi),體外培養(yǎng),7. 單克隆抗體的制取,體內(nèi)—腹腔接種,體外—培養(yǎng)罐法,17,思考：,1、如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？,2、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合？,18,謝謝祝：同學(xué)們學(xué)習(xí)進(jìn)步,19,