《單克隆抗體基礎(chǔ)知識(shí)PPT課件》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《單克隆抗體基礎(chǔ)知識(shí)PPT課件（28頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

單克隆抗體知識(shí),1,抗體是具有4條多肽鏈的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，其中2條較長、相對(duì)分子量較大的相同的重鏈（H鏈）；2條較短、相對(duì)分子量較小的相同的輕鏈（L鏈）。鏈間由二硫鍵和非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)形成一個(gè)由4條多肽鏈構(gòu)成的單體分子。輕鏈有κ和λ兩種，重鏈有μ、δ、γ、ε和α五種。 整個(gè)抗體分子可分為恒定區(qū)和可變區(qū)兩部分。在給定的物種中，不同抗體分子的恒定區(qū)都具有相同的或幾乎相同的氨基酸序列?？勺儏^(qū)位于“Y”的兩臂末端。在可變區(qū)內(nèi)有一小部分氨基酸殘基變化特別強(qiáng)烈，這些氨基酸的殘基組成和排列順序更易發(fā)生變異區(qū)域稱高變區(qū)。高變區(qū)位于分子表面，最多由17個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，少則只有2 ～ 3個(gè)。高變區(qū)氨基酸序列決定了該抗體結(jié)合抗原抗原的特異性。 一個(gè)抗體分子上的兩個(gè)抗原結(jié)合部位是相同的，位于兩臂末端稱抗原結(jié)合片段（antigen-binding fragment, Fab）?！癥“的柄部稱結(jié)晶片段（crystalline fragment,FC），糖結(jié)合在FC 上。,抗體是指能與相應(yīng)抗原特異結(jié)合的具有免疫活性的球蛋白,抗體的基本知識(shí),2,抗體結(jié)構(gòu)圖,抗體是指能與相應(yīng)抗原特異結(jié)合的具有免疫活性的球蛋白,抗體的作用機(jī)制：抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞溶解作用,3,單克隆抗體的制備方式： 1 傳統(tǒng)的單克隆抗體制備方法 2基因工程單克隆抗體制備方法 3未來單克隆抗體的發(fā)展方向,4,傳統(tǒng)的單抗制備方法,5,單克隆抗體在理論和實(shí)踐上的應(yīng)用成為解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等許多重大問題的重要手段。但是，上述應(yīng)用的單抗屬于鼠源性，鼠源性單抗應(yīng)用于人類的臨床應(yīng)用結(jié)果反映出了單克隆抗體藥物存在的一些問題 :(1) 鼠源性單抗容易容易產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA) ,在體內(nèi)作為異源蛋白被清除掉，從而削弱其治療的有效性 。(2) 鼠源性單抗在人體內(nèi)生物活性降低，不能有效地激活人體的生物效應(yīng)。,研究背景,因此，人們一直致力于人源性抗體的研究。,6,人源化治療性單克隆抗體的研究進(jìn)展,構(gòu)建的基本思路,鼠抗體人源化就是通過基因改造，使其和人體內(nèi)的抗體分子具有極其相似的輪廓，從而逃避人免疫系統(tǒng)的識(shí)別，避免誘導(dǎo)HAMA（人抗鼠抗體）反應(yīng)。遵守兩個(gè)原則首先，要保持抗體的親和力和特異性；其次，要降低或消除抗體的免疫原性。,7,以分子生物學(xué)技術(shù)提取、擴(kuò)增編碼人抗體的DNA，構(gòu)建質(zhì)粒，建立組合抗體文庫，再利用供者文庫建立針對(duì)某一特定抗原的子文庫。以該技術(shù)制備的抗體片段(Fab)是人源抗體，具有建庫簡單、抗體表達(dá)穩(wěn)定等特點(diǎn)。迄今已有多種抗體產(chǎn)生?？梢灶A(yù)見，該技術(shù)具有良好的發(fā)展和應(yīng)用前景。,解決方案：,（1）用人脾細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交；,（2）用EB病毒轉(zhuǎn)化人的B淋巴細(xì)胞；,（3）用基因工程法制備嵌合抗體等。,,效果不強(qiáng),（4）最新方法：——抗體庫篩選技術(shù)和轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù),8,單克隆抗體的發(fā)展史,第一代：鼠源性單抗,藥物特異性很強(qiáng)，副作用大，現(xiàn)在已經(jīng)漸漸退出市場。不過由于其代謝比較快，目前在放射性元素標(biāo)記的單克隆抗體藥物中使用。,第二代：人鼠嵌合性單抗,進(jìn)行人源化改造，使其人源化程度達(dá)到70%左右。,第三代：CDR移植抗體和SDR移植抗體,人源化程度達(dá)到95%左右，大大降低了毒副作用。,第四代：全人源化單抗,2002年，的世界首個(gè)藥物——阿達(dá)木單抗上市。人源化及全人源單克隆抗體由于副作用小，在體內(nèi)停留時(shí)間長，更有利于治療。,9,鼠源性單克隆抗體：鼠雜交瘤單克隆抗體主要是將來源于免疫接種過的小鼠的B 細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，繼而篩選出既能無限增殖又能分泌抗體的鼠雜交融合細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)行篩選、抗體制備和抗體純化。 嵌合性單克隆抗體：指用人的恒定區(qū)取代小鼠的恒定區(qū)，保留鼠單抗的可變區(qū)序列，形成一個(gè)人-鼠雜合的抗體。其研制程序快，可大幅度降低異源抗體的免疫原性，卻幾乎保持親本鼠單抗全部的特異性和親和力。另外，它還具有人抗體的效應(yīng)功能，如補(bǔ)體固定、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）等。 人源化單克隆抗體：利用現(xiàn)有的無數(shù)已詳細(xì)分析過的小鼠抗體，取其與抗原直接接觸的那段抗體片段（互補(bǔ)決定區(qū)，CDR）與人的抗體框架嫁接，經(jīng)親和力重塑，可維持其特異性和大部分的親和力，同時(shí)幾乎去除免疫原性和毒副作用。 全人源單克隆抗體：其抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗體制備的相關(guān)技術(shù)主要有：人雜交瘤技術(shù)、EBV 轉(zhuǎn)化 B 淋巴細(xì)胞技術(shù)、噬菌體顯示技術(shù)（phage display）、轉(zhuǎn)基因小鼠抗體制備技術(shù)（transgenic mouse）和單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)等。,10,11,1.嵌合抗體（Chimeric antibody),用人源基因代替鼠源單抗的恒定區(qū)，即該單抗由鼠的可變區(qū)和人的恒定區(qū)組成的嵌合抗體。,由于嵌合抗體可變區(qū)（V）約占整個(gè)抗體的30%，鼠源性抗體V區(qū)中的框架區(qū)（FR)仍殘留一定的免疫原性，可誘導(dǎo)HAMA反應(yīng)。,靈長目源抗體也是一類嵌合抗體，通過免疫短尾猿猴產(chǎn)生。由于其抗體的可變區(qū)與人可變區(qū)無差異，不至于發(fā)生抗體反應(yīng)。,缺點(diǎn),解決方案,鼠源抗體,嵌合抗體,,12,2.CDR移植抗體（CDR grafted antibody),真正意義上的抗體人源化?？贵w中除了3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）是鼠源的外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)，人源化程度可達(dá)到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。,不足,有時(shí)異基因的CDR人源化抗體可能引起抗個(gè)體基因型反應(yīng)。,改良方案,——進(jìn)行SDR移植改良,,嵌合抗體,人源化抗體,3個(gè)CDR,13,3.SDR移植抗體(SDR grafted antibody),在CDR移植抗體的基礎(chǔ)上，將異源抗體中與抗原結(jié)合密切相關(guān)的SDR等少數(shù)殘基移植到人抗體相應(yīng)位置上，進(jìn)一步降低了抗體的異源性。通過這種方法，使人源化的抗體潛在的免疫原性降至最低。,14,4.全人單克隆抗體（Fully humaneantibody),它是將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨(dú)特的優(yōu)越性。,4.1.抗體庫篩選技術(shù),4.1.1.噬菌體表面展示技術(shù),鼠源抗體,完全人源化抗體,,15,,基本原理和程序,噬菌體抗體庫,人免疫細(xì)胞基因組,,PCR技術(shù)擴(kuò)增,整套的抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因,,噬菌體DNA中有抗體基因 外殼表面有抗體分子的表達(dá),克隆并以融合蛋白的形式表達(dá),基因重組,噬菌體重組DNA,,,構(gòu)建,,利用抗原-抗體特異性,篩選所需抗體并進(jìn)行克隆擴(kuò)增,,獲得可溶性抗體片段,表達(dá),16,2018/9/24,局限性,1.在噬菌體展示過程中涉及細(xì)菌轉(zhuǎn)化、噬菌體包裝、展示跨膜分泌，這就大大限制了所建庫的容量和分子的多樣性。目前，常用的噬菌體展示文庫容量在109。2.不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達(dá)，因?yàn)橛行┑鞍踪|(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)需要折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、膜插入和絡(luò)合，導(dǎo)致在體內(nèi)篩選時(shí)需要外加選擇壓力。3.噬菌體展示文庫無法進(jìn)行有效的體外突變和重組進(jìn)而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。4.因?yàn)槭删w展示系統(tǒng)依賴于細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，所以一些對(duì)細(xì)胞有毒性的分子（如生物毒素分子)很難得到有效表達(dá)和展示。,17,4.1.2.核糖體展示技術(shù),基本原理和程序,人免疫細(xì)胞基因組,EDTA,,體外轉(zhuǎn)錄、翻譯、偶聯(lián),mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體,,核糖體展示的蛋白文庫,構(gòu)建,基因型和表型聯(lián)系,,利用抗原-抗體特異性,篩選所需抗體復(fù)合體,,EDTA解離,獲得特異mRNA,,RT- PCR,RT- PCR,特異抗體DNA子文庫,獲得特異性的、高親和力的抗體,,表達(dá),18,2018/9/24,傳統(tǒng)的篩選技術(shù)具有本身難以克服的缺陷，主要表現(xiàn)在構(gòu)建文庫和篩選時(shí)都涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)染、噬菌體包裝、跨膜分泌和蛋白質(zhì)降解等諸多方面的問題，文庫容量及其分子多樣性在某種程度上受到很大的限制，降低了文庫篩選效率。核糖體展示技術(shù)由于在體外無細(xì)胞翻譯體系中進(jìn)行，用mRNA的可復(fù)制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的限制。它大大的提高了文庫容量和篩選通量（1012-1014）而且能夠增加表達(dá)的蛋白質(zhì)的溶解度。,優(yōu)勢,19,4.2.轉(zhuǎn)基因小鼠,通過基因敲除技術(shù)，使小鼠自身的基因失活，并導(dǎo)入新基因，創(chuàng)造出攜帶人抗體重輕基因簇的轉(zhuǎn)基因小鼠。這種人抗體基因小鼠所攜帶的人DNA片段具有完善的功能，可以有效地進(jìn)行同型轉(zhuǎn)換和親和力成熟。任何靶抗原均可被用來免疫該小鼠，使其產(chǎn)生高親和力的人抗體。,案例：,日本麒麟公司用基因工程技術(shù)，使小鼠攜帶完整的人14號(hào)染色體，該染色體包含全部人抗體產(chǎn)生基因。,但迄今尚無該技術(shù)生產(chǎn)的制品問世。,20,4.3.微胞雜交干細(xì)胞技術(shù),——日本學(xué)者Ishida等首先提出,技術(shù)要點(diǎn)： 首先將抗G418的人成纖維細(xì)胞與小鼠的A9細(xì)胞融合，通過篩選，得到抗G418的小鼠A9細(xì)胞，再運(yùn)用PCR或原位熒光雜交方法篩選，先篩選出的細(xì)胞用秋水仙素處理48h，然后用細(xì)胞松弛素B處理并高速離心，分離出含2號(hào)、14號(hào)、22號(hào)染色體的小鼠。,人源抗體在這種轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)量還比較低。,21,4.4.其他方法,XTL生物制藥公司使用一種類似于人骨髓移植的方法，用放射線破壞動(dòng)物骨髓，然后注入人抗體生成細(xì)胞。該公司已用此法生產(chǎn)出一種全人單抗。,22,2018/9/24,近年來 ,人源化抗體和人抗體的出現(xiàn)為臨床應(yīng)用帶來了新的希望 ,當(dāng)前正處于臨床研究的多種抗體中 , 嵌合抗體和 人 源 化 抗 體 所 占 比 例 大 于70 %。目前的人源化抗體 ,主要用于腫瘤、 自身免疫性疾病和心血管疾病的治療以及抗移植排斥反應(yīng)和抗病毒感染等方面。,人源化抗體的臨床應(yīng)用,23,1 .在腫瘤治療方面的應(yīng)用:單抗藥物抗腫瘤能有效地降低傳統(tǒng)腫瘤藥物治療的不良反應(yīng)。如2005年我國開發(fā)出癌癥治療藥——重組人 源化抗人表皮生長因子受體單克隆抗體(商品名：泰欣生)。泰欣生聯(lián)合放療治療鼻咽癌的完全緩解率比單純放療的患者提高30%以上。 2 .在器官移植中的應(yīng)用: 近年來 ,利用抗體藥物作為實(shí)體器官移植的誘導(dǎo)治療逐漸增加。如1986年批準(zhǔn)進(jìn)入美國市場的治療性抗體類藥物抗 CD3單抗即被用于腎、 心臟、 肝臟移植排斥的逆轉(zhuǎn)。 3 .在心血管疾病方面的應(yīng)用：美國 FDA 于 1994 年批準(zhǔn)了第一個(gè)人-鼠嵌合 Fab 抗體的上市，該抗體現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于多種心血管疾病治療 ,主要用于預(yù)防冠狀動(dòng)脈成形術(shù)后的再狹窄。,2018/9/24,24,4 .在自身免疫性疾病方面的應(yīng)用:現(xiàn)有的研究表明 ,抗體對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡、 牛皮癬、 多發(fā)性硬化、 硬皮病、 潰瘍性結(jié)腸炎等療效較好。 5 . 在抗病毒感染方面的應(yīng)用：近年來研究表明 ,在 HBV、HCV、 HIV 等病毒感染性疾病中 ,人源化抗體顯示了較好的應(yīng)用前景。如：商品名為 SynagisTM的抗呼吸道病毒感染的抗體在美國已經(jīng)上市 ,為人源化的基因工程抗體。,2018/9/24,25,目前上市的單抗情況,26,未來抗體的發(fā)展方向,27,謝謝,28,