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第1講 微生物的培養(yǎng)與應用 [課時作業(yè)]　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　單獨成冊　方便使用 1．微生物強化采油(MEOR)是利用某些微生物能降解石油，增大石油的乳化度，降低石油粘度的原理，通過向油井中注入含微生物的水來提高采油率的新技術。以下是人們篩選、純化和培養(yǎng)該類微生物的實驗操作。請回答下列問題： (1)土壤是微生物的大本營，該類微生物應取自_________________________________的土壤。 (2)篩選和純化該類微生物時，除考慮微生物生長所需的營養(yǎng)外，還要考慮微生物生長所需的溫度、________以及是否需要O2等。倒平板時要待平板冷凝后，將平板倒置，其主要原因是________________________________________________________________________。 (3)在平板劃線接種時，為保證每次劃線都不能有雜菌污染，則每次劃線前都要________________，平板劃線結束后，最后一次劃的線不能與第一次劃的線__________。接種后還應密封培養(yǎng)的原因是__________，培養(yǎng)一段時間后在培養(yǎng)基上形成降油圈，此時選取__________就可獲得可能的高效菌株。在整個微生物的分離和培養(yǎng)中，一定要注意在__________條件下進行。 解析：(1)篩選、純化降解石油的微生物，應取長期被石油污染的土壤。(2)微生物的培養(yǎng)需要滿足微生物生長的營養(yǎng)條件以及溫度、pH和氣體情況等。平板倒置可防止培養(yǎng)皿蓋上的冷凝水落入培養(yǎng)基造成污染。(3)平板劃線法接種時，為降低每次劃線雜菌污染的概率，每次劃線前都要對接種環(huán)灼燒滅菌；劃線結束時，最后一次劃的線不能與第一次劃的線相交(相接、相連、交叉等)。密封培養(yǎng)是為了制造無氧環(huán)境，故該類降解石油的微生物的呼吸作用類型是厭氧型。培養(yǎng)一段時間后在培養(yǎng)基上會形成降油圈，降油圈的大小與菌種降解石油的能力有關，降油圈越大，菌種降解石油的能力越強。在微生物的分離和培養(yǎng)中，一定要注意在無菌條件下進行。 答案：(1)長期被石油污染(含石油多) (2)pH　防止培養(yǎng)皿蓋上的冷凝水落入培養(yǎng)基造成污染 (3)對接種環(huán)灼燒滅菌　相交(相接、相連、交叉等)　該類微生物是厭氧型　降油圈大的菌落　無菌 2．土壤中有些細菌含有脲酶，可通過降解尿素作為其生長的氮源。某課題小組通過“土壤取樣→選擇培養(yǎng)→梯度稀釋→鑒別培養(yǎng)”的實驗流程，從土壤中篩選出了降解尿素的菌株。請依據所學知識回答下列問題： (1)在篩選過程中，應將土壤樣品稀釋液接種于以__________為唯一氮源的固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)過程中，對培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿常采用的滅菌方法分別是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)在稀釋土壤溶液的過程中每一步都要在_________________________________ 旁進行操作。稀釋處理的目的是_________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)若培養(yǎng)基中存在能分解尿素的細菌，其菌落周圍會出現(xiàn)__________，這是由于尿素被分解產生___________________________________________________________________， 遇培養(yǎng)基中的酚紅指示劑產生顏色變化。變色區(qū)域越大，表明該菌株降解尿素的能力__________。與全營養(yǎng)培養(yǎng)基中的菌落相比，以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中菌落數(shù)__________(填“多”或“少”)。 解析：(1)欲篩選出能降解尿素的菌株，應選擇以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基。實驗室常用的滅菌方法有灼燒滅菌法(如接種環(huán))、干熱滅菌法(如培養(yǎng)皿)和高壓蒸汽滅菌法(如培養(yǎng)基)等。(2)整個實驗過程需要在無菌條件下進行，故稀釋土壤溶液要在酒精燈火焰附近進行，以避免周圍環(huán)境中微生物的污染。為了得到單菌落，需將土壤溶液進行一系列的梯度稀釋，從而使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，進而能在培養(yǎng)基表面形成單菌落，以便于分離純化菌種。(3)分解尿素的細菌合成的脲酶將尿素分解產生了氨，氨使培養(yǎng)基的pH升高，使酚紅指示劑變紅。降解尿素能力越強的菌株，產生的氨越多，在菌落周圍形成的紅色環(huán)帶越大。全營養(yǎng)培養(yǎng)基的營養(yǎng)全面，生長的菌落數(shù)多，而以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中只有具備降解尿素能力的細菌才能生長，故以尿素為氮源的培養(yǎng)基中菌落數(shù)少。 答案：(1)尿素　高壓蒸汽滅菌法、干熱滅菌法　(2)酒精燈火焰　得到單菌落，避免土壤溶液中菌體濃度過高　(3)紅色環(huán)帶　氨　越強　少 3．制備培養(yǎng)基方法：將蛋白胨、NaCl和牛肉膏放入燒杯內，加200 mL蒸餾水，用玻璃棒攪勻后，在酒精燈上加熱。當?shù)鞍纂恕⑴Ｈ飧嗳诨?，加入瓊脂，用微火繼續(xù)加熱至瓊脂溶化，補充水至200 mL。用0.1 mol/L的NaOH溶液或0.1 mol/L的HCl溶液將pH調至7.0～7.2，分別對培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進行高壓蒸汽滅菌。當培養(yǎng)基的溫度下降到50 ℃時，將其分裝在5套培養(yǎng)皿中，當培養(yǎng)基冷卻至室溫，按下表分別進行處理。將處理完畢的培養(yǎng)基置于35 ℃的溫度下培養(yǎng)2～3天，觀察每個培養(yǎng)基中的細菌生長情況。請回答下列問題： 第1套 開蓋，在空氣中暴露10 s 第2套 用手指接觸培養(yǎng)基約10 s 第3套 用硬幣接觸培養(yǎng)基約10 s 第4套 用濾紙擦一下課桌，再接觸培養(yǎng)基約10 s 第5套 對照(不打開蓋) (1)該培養(yǎng)基中，蛋白胨提供的主要營養(yǎng)是__________________________________， 此外，培養(yǎng)基中還必須含有的營養(yǎng)物質有水和___________________________。 該培養(yǎng)基因其中加入了瓊脂而被稱為____________________________________， 另外因含有牛肉膏、蛋白胨等成分而被稱為______________________________。 (2)除上述滅菌方法外，還可用__________和________________________________ 方法滅菌，其中后者主要適用于金屬工具。以上方法能夠殺死物體內外的__________，與之相比，消毒是指使用__________方法殺死物體內外的__________。 (3)在實驗操作中，“當培養(yǎng)基的溫度下降到50 ℃時，將其分裝在5套培養(yǎng)皿中”的過程稱為__________，“當培養(yǎng)基冷卻至室溫”后應該__________。實驗中將高壓蒸汽滅菌后培養(yǎng)基的溫度下降到50 ℃的目的是防止_______________________________________。 解析：(1)該培養(yǎng)基中，蛋白胨提供的主要營養(yǎng)是碳源氮源和維生素。培養(yǎng)基中還必須含有的營養(yǎng)物質有水和無機鹽。培養(yǎng)基因加入了瓊脂而被稱為固體培養(yǎng)基。牛肉膏、蛋白胨等成分為天然成分，含有這些成分的培養(yǎng)基為天然培養(yǎng)基。(2)常用的滅菌方法有高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌、灼燒滅菌等，滅菌可以徹底殺死物體內外的全部微生物。消毒是指使用較為溫和的物理或化學方法殺死物體內外的部分微生物。(3)“當培養(yǎng)基的溫度下降到50 ℃時，將其分裝在5套培養(yǎng)皿中”的過程稱為倒平板。“當培養(yǎng)基冷卻至室溫”后應該將平板倒置，防止冷凝水污染培養(yǎng)基，影響實驗結果。實驗中將高壓蒸汽滅菌后培養(yǎng)基的溫度下降到50 ℃的目的是防止培養(yǎng)基的溫度過高使培養(yǎng)皿因受熱不均而破裂。 答案：(1)碳源、氮源和維生素　無機鹽　固體培養(yǎng)基　天然培養(yǎng)基 (2)干熱滅菌　灼燒滅菌　全部微生物　較為溫和的物理或化學　部分微生物　(3)倒平板　將平板倒置　培養(yǎng)基的溫度過高使培養(yǎng)皿因受熱不均而破裂 4．回答與微生物實驗室培養(yǎng)有關的問題： (1)在制備固體培養(yǎng)基時需加入的常用凝固劑是_____________________________。 若培養(yǎng)基需調節(jié)pH，則應在滅菌之________(填“前”或“后”)調節(jié)。 (2)為防止外來雜菌入侵，對______________________________________________ 等可采用干熱滅菌法進行滅菌。 (3)如圖為平板劃線法接種后的示意圖。在劃線接種的整個操作過程中，對接種環(huán)至少需進行__________次灼燒滅菌。接種后蓋上皿蓋，將平板____________放入恒溫箱中培養(yǎng)，這樣放置的目的是__________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)用稀釋涂布平板法統(tǒng)計活菌數(shù)目時，每隔一個“時間間隔”統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，最后選取____________________作為結果，這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而遺漏菌落的數(shù)目。 解析：(1)制備固體培養(yǎng)基通常加入的凝固劑是瓊脂。培養(yǎng)基若在滅菌后調pH，可能會造成培養(yǎng)基的污染，故培養(yǎng)基調pH應在滅菌前進行。(2)滅菌的方法通常有高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌和灼燒滅菌三種。采用干熱滅菌的通常有玻璃和金屬用具。(3)平板劃線接種過程中需在接種前、每次劃線后對接種環(huán)灼燒滅菌。圖中共接種5個區(qū)域，故接種環(huán)至少需要進行6次灼燒滅菌處理。微生物培養(yǎng)過程中，易產生冷凝水，為防止水珠滴在培養(yǎng)基表面影響微生物生長，培養(yǎng)時需將培養(yǎng)基倒置。(4)用稀釋涂布平板法統(tǒng)計活菌數(shù)目時，要以菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄為最終結果，這樣可以防止因遺漏而導致統(tǒng)計結果偏小。 答案：(1)瓊脂　前　(2)玻璃器皿和金屬用具　(3)6　倒置　避免培養(yǎng)基被污染和防止培養(yǎng)基水分過快揮發(fā) (4)菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄 5．燒傷病人容易感染綠膿桿菌，引起化膿性感染，比阿培南、美羅培南、頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素都是非常經典的抗綠膿桿菌的藥物。臨床使用抗生素前，有時需要做細菌耐藥實驗。實驗時，從病人身上獲取少量樣本，按照一定的實驗步驟操作，以確定該病人體內的綠膿桿菌對不同抗生素的敏感性。 (1)獲取綠膿桿菌單菌落：配制適于綠膿桿菌生長的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分一般含有________、________、水和無機鹽，調節(jié)pH至7，滅菌處理，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃時，在________________附近倒平板。經過選擇培養(yǎng)、鑒別等步驟獲得單菌落。 (2)檢測綠膿桿菌對不同抗生素的敏感性：取該單菌落適當稀釋，用________法接種于固體培養(yǎng)基表面，使其均勻生長，布滿平板。將分別含等劑量的比阿培南、美羅培南、頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素的同大小的濾紙片均勻置于該平板的不同位置，適宜條件下培養(yǎng)一段時間，結果是含不同抗生素的濾紙片周圍均出現(xiàn)透明圈，這說明綠膿桿菌對上述抗生素________；含頭孢菌素的濾紙片周圍的透明圈比含美羅培南的小，這說明____________________________；含比阿培南、碳青霉烯類的濾紙片周圍的透明圈也比含美羅培南的小，且比阿培南透明圈中出現(xiàn)了一個菌落，請推測此菌落產生的可能原因：一是________________，二是________________。 (3)根據上述實驗結果，為達到抗綠膿桿菌的目的，對于該患者來說最好應選用抗生素____________。 解析：(1)綠膿桿菌為異養(yǎng)型微生物，培養(yǎng)基中需要加入碳源、氮源、水和無機鹽等成分。接種時為防止污染應在酒精燈火焰附近的無菌區(qū)接種。(2)含等劑量、不同種抗生素處理的濾紙片周圍均出現(xiàn)透明圈，說明綠膿桿菌對不同種抗生素均敏感。含頭孢菌素的濾紙片周圍的透明圈比含美羅培南的小，說明綠膿桿菌對頭孢菌素的敏感性比對美羅培南的弱。比阿培南的透明圈中出現(xiàn)一個菌落的可能原因是被其他雜菌污染或綠膿桿菌產生了耐藥性突變。(3)綠膿桿菌對美羅培南的敏感性最強，患者服用后抑制綠膿桿菌的效果最好。 答案：(1)碳源　氮源　酒精燈火焰　(2)涂布　敏感　綠膿桿菌對頭孢菌素的敏感性比對美羅培南的弱　雜菌污染　抗比阿培南的綠膿桿菌(或綠膿桿菌產生耐藥性突變)形成的菌落　(3)美羅培南 6．土壤中有些細菌含有可降解尿素的脲酶。如圖是某同學從土壤中篩選能降解尿素的菌株的實驗流程。請回答相關問題： 配制土壤溶液→系列稀釋→涂布平板與培養(yǎng)→菌落計數(shù) (1)用以__________為唯一氮源的培養(yǎng)基篩選能分泌脲酶的細菌。從功能上講，該培養(yǎng)基屬于__________培養(yǎng)基。為了防止雜菌污染，培養(yǎng)細菌時必須在__________條件下進行。 (2)采用__________法接種時需要將樣液進行一系列的梯度稀釋，然后接種培養(yǎng)、菌落計數(shù)。在稀釋土壤溶液的過程中每一步都要在__________旁進行操作。將接種后的培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，將平板倒置的目的是____________________。 (3)向培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若培養(yǎng)基中存在可合成脲酶的細菌，其菌落周圍會出現(xiàn)紅色，這是尿素被分解產生的__________使酚紅指示劑顯色的結果。變色區(qū)域越大，表明該菌株降解尿素的能力__________。 解析：(1)欲篩選出能降解尿素的菌株，配制培養(yǎng)基時應以尿素為唯一氮源，這樣不能降解尿素的細菌在此培養(yǎng)基上就不能生存，這類培養(yǎng)基屬于選擇培養(yǎng)基。培養(yǎng)細菌時必須保證無菌操作。(2)在統(tǒng)計菌落數(shù)目時，常用的接種方法是稀釋涂布平板法，整個實驗操作過程都要在酒精燈火焰附近進行，以避免周圍微生物的污染。將平板倒置的目的是防止培養(yǎng)過程中培養(yǎng)皿蓋上的冷凝水滴落在培養(yǎng)基表面，造成雜菌污染。(3)酚紅指示劑變紅的原因是細菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，而氨使培養(yǎng)基的堿性增強，pH升高。降解尿素能力越強的菌株，在菌落周圍形成的紅色環(huán)帶越大。 答案：(1)尿素　選擇　無菌 (2)稀釋涂布平板　酒精燈火焰　防止皿蓋上的冷凝水落入培養(yǎng)基，造成污染 (3)氨(NH3)　越強 7．阿拉伯膠是一種多糖，研究者從某土樣中發(fā)現(xiàn)一種能合成阿拉伯膠降解酶的菌株S。請回答： (1)欲從該土樣中分離菌株S，需使用以__________為唯一碳源的培養(yǎng)基。接種后需將培養(yǎng)皿倒置并放在__________中培養(yǎng)。 (2)微生物培養(yǎng)過程中，獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是__________，實驗中對培養(yǎng)基常用__________法進行滅菌。 (3)在顯微鏡下觀察分離得到的菌株S，發(fā)現(xiàn)其菌絲白色致密，細胞核直徑約1 μm，初步推測菌株S屬于_______________________________________________________ (填“細菌”或“真菌”)。根據這一推測，該菌株的培養(yǎng)基pH應調至呈__________。 (4)欲對菌株S產生的阿拉伯膠降解酶的活力進行測定，應選用下表中__________配方，不選用其他配方的原因是 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 配方 阿拉伯膠 阿拉伯膠酶 NaNO3 K2HPO4 MgSO47H2O KCl FeSO47H2O 甲 25 g/L 1 g/L 1 g/L 0.5 g/L 0.01 g/L 乙 25 g/L 1 g/L 3 g/L 1 g/L 1 g/L 0.5 g/L 0.01 g/L 丙 25 g/L 3 g/L 1 g/L 1 g/L 0.5 g/L 0.01 g/L 解析：(1)篩選能降解阿拉伯膠的菌株S需要使用以阿拉伯膠為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基。接種后需將培養(yǎng)皿倒置并放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)微生物培養(yǎng)過程中，獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是無菌，實驗中對培養(yǎng)基常用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌。(3)在顯微鏡下觀察分離得到的菌株S，發(fā)現(xiàn)其菌絲白色致密，細胞核直徑約1 μm，初步推測菌株S屬于真菌。培養(yǎng)真菌的培養(yǎng)基pH應調至呈酸性。(4)若對菌株S中阿拉伯膠降解酶的活力進行測定，則必須以阿拉伯膠為唯一碳源，同時需要加入氮源，因此應選用題表中丙配方。甲培養(yǎng)液缺少氮源，菌株S不能很好生長；乙培養(yǎng)液有阿拉伯膠酶，會影響對菌株S自身產生的酶活力的測定結果。 答案：(1)阿拉伯膠　恒溫培養(yǎng)箱 (2)無菌　高壓蒸汽滅菌 (3)真菌　酸性 (4)丙　甲培養(yǎng)液缺少氮源，菌株S不能很好生長；乙培養(yǎng)液有阿拉伯膠酶，會影響對菌株S自身產生的酶活力的測定結果 8．圖示為稀釋涂布平板法的操作流程。請回答下列問題： (1)實驗室獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是_________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)圖示流程的主要操作包括__________和__________。 (3)一般選擇菌落數(shù)在__________的平板進行計數(shù)，結果比較準確。 (4)當培養(yǎng)基中纖維素成為唯一碳源時，可篩選出________________。要證明其有選擇作用，可以用__________作對照，比較菌落數(shù)目；還可以在培養(yǎng)基中加入剛果紅染料，如果________________________________________________________________________， 也證明其選擇作用。 解析：(1)實驗室獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是防止外來雜菌的入侵(即無菌操作)。(2)圖示流程的主要操作包括梯度稀釋和涂布平板。(3)一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)，結果比較準確。(4)當培養(yǎng)基中纖維素成為唯一碳源時，可篩選出分解纖維素的細菌。要證明其有選擇作用，可以用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作對照，比較菌落數(shù)目；還可以在培養(yǎng)基中加入剛果紅染料，如果所有菌落周圍均出現(xiàn)明顯的透明圈，也證明其選擇作用。 答案：(1)防止外來雜菌的入侵(無菌操作) (2)梯度稀釋　涂布平板　(3)30～300 (4)分解纖維素的細菌　牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基　所有菌落周圍均出現(xiàn)明顯的透明圈