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1,第十章 臨床分子生物學診斷 （ Clinical Molecular Biology Diagnosis ）,2,學習內容,了解流式細胞術及染色體檢測在臨床中的應用熟悉分子生物學常用技術及在臨床診斷中的地位掌握基因診斷的定義及在臨床診斷中的應用（重點）,3,分子生物學概念,在分子水平上研究生命現(xiàn)象的科學。通過研究生物大分子(核酸、蛋白質)的結構、功能和生物合成等方面內容，闡明各種生命現(xiàn)象的本質。,正常生命現(xiàn)象－本質疾病－診斷,4,運用分子生物學的理論和技術，對來自人體的血液、骨髓、體腔液、排泄物、分泌物和組織細胞等標本進行各種檢測，獲得有關病原體、核酸及蛋白質改變等方面的實驗信息，為疾病診斷、治療方案選擇、療效監(jiān)測、預后評估等提供客觀依據，并為疾病的防治、健康普查與咨詢等做出正確的評價。,臨床分子生物學檢測概念,5,Gene Diagnosis,第一節(jié) 基因診斷,6,以DNA或RNA為檢查對象，應用分子生物學技術，通過檢查基因的結構或表達量的改變，對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程。遺傳物質可以是外源性基因，也可以是內源性基因。,一、基因診斷的定義：,7,基因診斷的主要內容,基因突變分析 基因連鎖分析 基因表達分析 病原體診斷,8,二、基因診斷在診斷學中的位置,9,基因診斷的基礎是醫(yī)學基礎，專業(yè)基礎是醫(yī)學分子生物學和醫(yī)學遺傳學，不同的是我們在基因水平上研究：基因結構（解剖）、基因轉錄翻譯等（生理）、基因結構異常（病理），基因表達異常（病生），然后主要應用分子生物學技術手段進行基因診斷。,基因診斷遵循診斷學的基本原則,10,染色體數(shù)量變異：包括整倍體和非整倍體 染色體結構變異：染色體在體內外因素作用下，發(fā)生斷裂和愈合過程中的異常改變。,三、遺傳變異,缺失：指染色體部分丟失，主要有末端和中間缺失兩種 倒位：指一條染色體發(fā)生兩處斷裂，中間部分顛倒順序再連接 易位：某個染色體斷片位置移到另一處或另一個染色體的新位置上 插入：兩處斷裂產生的中間一段染色體轉移到同一染色體或另一條染色體的一個斷裂處并重新連接 重復：染色體中增加的額外染色體成分，是染色體個別區(qū)帶或片段的重復,11,１．轉換： 指DNA上發(fā)生的單個堿基的置換，一種嘌呤被另一種嘌呤所置換；或一種嘧啶被另一種嘧啶所置換。 ２．顛換： 指一種嘌呤被另一種嘧啶所置換，或一種嘧啶被另一種嘌呤所置換。 ３．缺失： 指DNA鏈被刪除一個或多個堿基對，常引起嚴重的表型改變。 ４．插入： 指DNA鏈中插入一對或幾對堿基。,四、基因突變,指DNA中核苷酸排列順序或組成發(fā)生的變化,（一）按基因突變性質劃分,突變可分為長度變化和點突變，后者又分為兩種：轉換和顛換,12,1．錯義突變： DNA中核苷酸發(fā)生置換后，改變了遺傳密碼，使一種氨基酸變成另一種氨基酸，影響到所合成蛋白質的結構和功能。 2．無義突變： 當DNA突變后，使原來編碼某一氨基酸的密碼子變成終止密碼子時，多肽鏈停止合成，提前釋放出不完全的蛋白質，造成功能喪失。 3．同義突變： 指由于遺傳密碼是兼并的，決定一種氨基酸的密碼子常常不止一個，因此DNA中某些堿基置換只造成三聯(lián)密碼中第三個核苷酸發(fā)生改變，不改變氨基酸。 4．移碼突變： 即DNA鏈中插入或缺失一個或多個堿基對后，使讀碼格式發(fā)生改變，自突變點3’方向以后的一系列密碼都改變，造成肽鏈大范圍錯誤。,（二）按基因突變結果劃分,根據突變發(fā)生的位置和突變性質，會使遺傳密碼的閱讀框和蛋白質翻譯發(fā)生變化，可分為：,13,五、基因診斷常用技術,核酸分子雜交 DNA序列測定 聚合酶鏈反應 連接酶鏈式反應 單鏈構象多態(tài)性分析 限制性片段多態(tài)性分析 單核苷酸多態(tài)性 DNA芯片技術,Southern 、Northern 印跡雜交、斑點雜交、原位雜交,14,（一）核酸分子雜交技術,核酸分子雜交是指兩條互補單鏈核酸（DNA或RNA）在一定條件下按堿基互補原則退火形成雙鏈的過程,特點：,分子雜交的基礎是堿基對之間非共價鍵形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū) 雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA之間進行 都采用了同位素或非同位素標記的探針,15,待測核酸制備,濾膜上核酸固化,雜 交,去除未參與雜交的探針,,,,,檢 測 雜 交 信 號,制備探針核酸片段,,探 針 標 記,,加入標記核酸探針,,核酸分子雜交的流程示意圖,16,1. Southern印跡法,是最經典的基因分析方法，不但能檢出特異的DNA片段，而且能進行分子量大小測定，可用于基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等。,主要步驟：,不同來源DNA樣品（限制性內切酶切割） 凝膠電泳分離 堿變性使DNA解離成單鏈 毛細管虹吸或電轉移法到硝酸纖維素膜 洗滌、涼干、80℃烤箱中加溫2小時用于雜交 探針于100℃變性處理 顯色,17,斑點雜交結果,2. Northern印跡法,用于組織細胞中總RNA或mRNA的定性和定量分析,同Southern雜交 注意RNA酶的處理 電泳須在含甲醛或乙二醛的變性凝膠中進行,主要步驟：,3. 斑點雜交 Dot Blotting,用于基因組中特定基因及其表達產物的定性及半定量分析，方法簡單、快速靈敏、樣品用量少；其缺點是不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高。,18,組織或細胞的原位雜交，是經適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補序列在胞內的空間位置，并可顯示細胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術。,4. 原位雜交 In Situ Hybridization,19,確定DNA雙股鏈上每一個獨立結構單元或堿基的確切順序的過程,（二）DNA序列測定,DNA測序的方法,鏈終止法測序 化學降解法測序 自動化測序,（DNA Sequencing）,20,1、鏈終止法測序,基本原理:,在合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈時，由于合成的互補鏈可在不同位置隨機終止反應，產生只差一個核苷酸的DNA分子，從而可讀取待測DNA分子的順序。,21,脫氧核苷酸的連接,22,雙脫氧核苷酸不能連接,,23,制備單鏈模板↓ 將單鏈模板與引物退火↓ 加入DNA多聚酶及4種脫氧核苷酸↓ 分別加入少量4種雙脫氧核苷酸↓ 將4種反應產物分別在4條泳道電泳↓ 根據4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列,技術路線,24,,25,A T G G T A C C G C A T,26,2、化學降解法測序,基本原理:,在選定的核苷酸堿基中引入化學基團,再用化合物處理,使DNA分子在被修飾的位置降解。,雙鏈DNA變性為單鏈↓ 同一方向末端標記，以顯示DNA條帶↓ 不同方法處理,獲得只差一個核苷酸的降解DNA群體↓ 電泳,讀取DNA核苷酸順序,技術路線:,27,,Maxam-Gilbert 法所用的化學技術,28,,,,哌啶,化學法測序實例,29,3、自動化測序,基本原理:,與鏈終止法測序原理相同，只是用不同的熒光素分別標記ddNTP，如ddATP標記紅色熒光，ddCTP標記藍色熒光，ddGTP標記黃色熒光，ddTTP標記綠色熒光。由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色，而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基。,30,31,32,（三）聚合酶鏈式反應,類似于DNA的天然復制過程，擴增產物大小依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,模板DNA的變性：94℃數(shù)分鐘，雙鏈解離成單鏈 模板DNA與引 物退火：55℃左右，引物與模板DNA互補序列結合 引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的新鏈,PCR（體外核酸擴增技術）基本原理 ：,PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：,（Polymerase Chain Reaction，PCR）,33,特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化； 能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷； 可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定。,PCR（體外核酸擴增技術）特點 ：,34,,,,,變性,退火,延伸,,百萬倍擴增,35,PCR技術已廣泛應用,36,（四）連接酶鏈式反應,連接酶鏈反應，是一種新的DNA體外擴增和檢測技術,程序：在模板DNA、DNA連接酶、寡核苷酸引物存在條件下，加熱94℃變性，雙鏈打開，然后降溫退火(65℃)，引物與之互補的模板DNA結合并留下一缺口，引物與靶序列完全互補，DNA連接酶即可連接封閉這一缺口，則LCR反應的三步驟(變性-退火-連接)就能反復進行，否則空間結構發(fā)生變化，連接反應不能進行。 應用：點突變、微生物病原體、單堿基遺傳病，微生物的種型鑒定等研究。,（ligase Chain Reaction, LCR）,37,單鏈構象多態(tài)性檢測是一種基于單鏈DNA構象差別檢測點突變的方法。單鏈DNA片段呈復雜的空間構象，主要是由其內部堿基相互作用力維持的，當某個堿基發(fā)生改變時，其空間構象發(fā)生改變，相同長度的單鏈DNA形成的構象不同，由此形成單鏈構象多態(tài)性，在非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)中受排阻大小不同，可以將構象上有差異的分子分離開。,（五）單鏈構象多態(tài)性,（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）,38,SSCP 示意圖,39,限制性內切酶可特異識別DNA堿基序列并對其進行切割，當基因組中的核苷酸發(fā)生突變時可造成限制酶切位點的改變，用限制酶切割基因所產生的限制性片段的數(shù)目和每個片段的長度就不同，稱之為限制性片段長度多態(tài)性。能導致限制性片段發(fā)生改變的酶切位點又稱為多態(tài)性位點。,（六）限制性片段長度多態(tài)性分析,（ Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP ）,40,RLFP分析法,41,42,是指在基因組上單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,包括置換、顛換、缺失和插入。是人類可遺傳的變異中最常見的一種，在人群中的發(fā)生率大于1%。,1.密度高 2.具有疾病關聯(lián)性 3.遺傳穩(wěn)定性 4.檢測手段易實現(xiàn)自動化,（七）單核苷酸多態(tài)性,（ Single Nucleotide Polymorphism，SNP ）,特點：,43,指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達的信息）由于在制備過程中運用了計算機芯片的制備技術如顯微光蝕刻、顯微打印等，且常用硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片技術,（八）基因芯片技術,44,基因芯片,45,1.優(yōu)生優(yōu)育與遺傳性疾病 2.對疾病做出診斷 3.器官、組織移植的配型 4.病原體診斷 5.環(huán)境對人體影響檢測 6.法醫(yī)學方面的鑒定,應用范圍：,通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術具有多種不同的應用價值，如基因表達譜測定、實變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等。,46,1.遺傳性疾病的基因診斷 2.感染性疾病的基因診斷 3.腫瘤的基因診斷 4.法醫(yī)學中的應用,六、基因診斷在臨床醫(yī)學中的應用,47,第二節(jié) 流式細胞術及臨床應用,48,一、流式細胞儀的基本介紹,利用流式細胞儀對處在快速、直線、流動狀態(tài)中的單細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現(xiàn)代細胞分析技術。,49,集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的一種新型高科技儀器。,流式細胞儀（Flow Cytometer),50,,,,,,單細胞懸液或生物顆粒,,分析速度高,,多參數(shù),,精度高,,當代最先進的細胞定量分析技術,可分選,流式細胞儀特點,51,液流系統(tǒng)流動室液流驅動系統(tǒng) 光學系統(tǒng)激光光源光收集系統(tǒng) 電子系統(tǒng)光電轉換數(shù)據處理系統(tǒng) 細胞分選系統(tǒng),二、流式細胞儀的基本構造,52,信號產生-散射光信號,當顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC） 與激光束垂直的稱為側向角散色光信號（SSC）,53,FSC，前向角散射光，代表細胞大小 SSC，側向角散射光，代表細胞粒度,54,信號產生-熒光信號,當熒光抗體或其他染料染色的顆粒通過激光束時，染料吸收光子躍遷到激發(fā)態(tài)，返回基態(tài)時，染料釋放出能量，大部分以光的形式釋放。,55,單參數(shù)直方圖雙參數(shù)圖二維散點圖等高線圖和密度圖假三維圖三維圖,三、流式細胞儀數(shù)據顯示方式,56,X軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用“道數(shù)”表示，根據選擇放大器類型不同，可以是線性標度或對數(shù)標度 Y軸：代表該通道內所出現(xiàn)具有相同光信號特征性細胞的頻率,單參數(shù)直方圖,57,細胞雙參數(shù)測定不僅能提供二個參數(shù)各自與細胞數(shù)量的關系，更重要的是獲得了這二個參數(shù)之間的相關關系，其中包含了更多的生物學信息。在二維圖上，橫軸代表第一個測量參數(shù)，縱軸代表第二個測量參數(shù)。,雙參數(shù)數(shù)據顯示,58,縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量參數(shù),在圖中每一個點代表一個細胞,二位散點圖,59,用等高線來表示細胞數(shù)，在一條等高線上細胞數(shù)相同，不同的等高線上細胞數(shù)不同。,二位等高線圖和密度圖,60,利用計算機技術對二維等高線圖的之中視覺直觀的表現(xiàn)方法，縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量參數(shù),Z軸為細胞數(shù)。,假三維圖,61,三維圖,任意選擇三個參數(shù)為X、Y、Z軸構成的圖像，三維坐標勻為參數(shù)（散射光或熒光）而非細胞數(shù)。,62,流式細胞儀檢測范圍,細胞大小 細胞粒度 細胞表面面積 DNA含量與細胞周期 RNA含量 蛋白質含量,細胞結構,,,,,,,特異性抗原 （細胞表面/胞漿/核） 細胞內細胞因子 細胞活性 酶活性 激素結合位點 細胞受體,細胞功能,,,,,,,凡細胞內能進行熒光標記的成分或變化都可用流式細胞儀進行檢測,四、流式細胞儀的應用,63,DNA分析,1. 細胞周期檢測,64,Sub G1,發(fā)生凋亡的細胞由于核內DNA裂解成許多小片段，在乙醇固定過程中小分子DNA片段穿過胞膜丟失，造成凋亡細胞內DNA含量減少，出現(xiàn)一個DNA含量小于2n的亞”G1”峰。,2. 細胞凋亡分析,65,3. 細胞增值的檢測與分析,CFSE單參數(shù)法,CFDA-SE（羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯）是一種非極性分子，進入細胞后可以被分解成CFSE，不可逆地和細胞內蛋白的Lysine殘基或其它氨基結合。 被CFDA -SE標記的非分裂細胞的熒光非常穩(wěn)定，穩(wěn)定標記的時間可達數(shù)個月。當細胞分裂時。CFSE標記物平均分配到兩個子代細胞，因此其熒光強度是親代的一半。,66,,圖中細胞被標記并刺激后，可跟蹤細胞的分裂。配合使用Modfit軟件分析，可確定每代的細胞數(shù)。,細胞增殖的檢測與分析,67,4. 細胞相對大小和顆粒性分析,68,5. 細胞活性分析,Fluorescein Diacetate（二乙酸熒光素）進入活細胞后,被胞內酯酶降解，生成熒光底物.活細胞會發(fā)綠色熒光,69,Granulocytes,,Monocytes,,,Basophils,Lymphocytes,,,T Helper,T Cytotoxic,,,,,,,Peripheral White Blood Cells CD45+,,,CD3+ CD4+,CD3+ CD8+,CD3+,CD3- CD19+ HLA-DR+,CD3- CD16+ CD56+,Monocytes,6. 細胞表面分子的檢測與分析,Lysed Whole Blood Components,70,T淋巴細胞,T淋巴細胞檢測,淋巴細胞,71,B淋巴細胞檢測,淋巴細胞,B淋巴細胞,72,NK細胞檢測,淋巴細胞,NK細胞,73,第三節(jié) 熒光原位雜交,(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH),74,利用生物素或地高辛等非放射性物質標記探針，并通過熒光素偶聯(lián)的抗原-抗體檢測系統(tǒng)，在組織、細胞及染色體上對DNA或RNA進行定性或定位分析。,標 記 物：,脫氧尿嘧啶三磷酸 Bio-11-dUTP(生物素) Dig-11-dUTP(地高辛),標記方法：缺口平移法，隨機引物法,75,特點 1 熒光試劑和探針經濟、安全； 2 探針穩(wěn)定，一次標記后可在兩年內使用； 3 實驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確； 4 可定位1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當； 5 多色FISH通過顯示不同顏色可同時檢測多種序列； 6 既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結構的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。,76,熒光標記原位雜交原理,實驗流程：FISH樣本的制備→探針的制備→探針標記→雜交→ （染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測→結果分析。,77,整條染色體涂染探針 染色體重復序列探針 染色體專一位點探針,染色體FISH探針,實驗流程：,FISH樣本的制備→探針的制備→探針標記→雜交→ （染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測→結果分析。,78,整條染色體涂染,易位染色體,染色體重復序列探針,染色體專一位點探針,79,謝 謝,祝同學們考出好成績,