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1 色譜分析法 概述色譜有關術語色譜法基本原理基本色譜分離方程式 2 歷史 色譜法起源 3 1931年胡蘿卜素植物色素分離1936年離子交換色譜建立1940年吸附色譜與電泳相結合1941年分配色譜創(chuàng)立1952年氣相色譜法建立1967年高效液相色譜法建立80年代后離子色譜 超臨界流色譜 高效毛細管電泳 色譜法發(fā)展歷史 4 Tiselius A W K Martin A J P Synge R L M 1948年Nobel化學獎1952年Nobel化學獎吸附色譜與電泳分配色譜 色譜法發(fā)展歷史 5 色譜法概述 色譜法是一種物理化學分離方法 利用不同物質(zhì)在兩相 固定相和流動相 中具有不同的分配系數(shù) 或吸收系數(shù) 滲透性等 當兩相做相對運動時 這種物質(zhì)在兩相中反復多次分配 從而使各物質(zhì)得到完全的分離 色譜法的分類 按流動相與固定相的分子聚集狀態(tài)分類 氣相色譜法 液相色譜法 超臨界流體色譜法 氣固色譜法 氣液色譜法 液固色譜法 液液色譜法 按操作形式分類 柱色譜法 平面色譜法 紙色譜法 薄層色譜法 按分離機制分類 吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法空間排阻色譜法 色譜法簡單分類 9 分類 色譜法分類 10 氣相色譜 Gaschromatography 填充柱氣相色譜 Packedcolumngaschromatography 毛細管氣相色譜 Capillarycolumngaschromatography 裂解氣相色譜 Pyrolysisgaschromatography 頂空氣相色譜 Headspacegaschromatography 氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術 Gaschromatography Massspectrometry 液相色譜 Liquidchromatography 高效液相色譜 Highperformanceliquidchromatography 超臨界流體色譜 Supercriticalfluidchromatography 高效毛細管電泳 Highperformancecapillaryelectrophoresis 毛細管電色譜 Capillaryelectrochromatography 液相質(zhì)譜聯(lián)用技術 Liquidchromatography Massspectrometry 色譜法分類 11 平面色譜法 Planarchromatography 薄層色譜 Thinlayerchromatography 薄層電泳色譜 Thinlayerelectrophoresis 紙色譜 Paperchromatography 色譜法分類 12 色譜法的特點 與其它分析方法相比 具有的優(yōu)點 分離效能高靈敏度高 分析速度快應用范圍廣缺點 對未知物的定性比較困難解決方法 與其它分析方法聯(lián)用 質(zhì)譜 紅外和電化學等 高分離效能 高靈敏度 在較短的時間內(nèi)能同時分離和測定極為復雜的混合物 如采用毛細管氣相色譜柱分析40 150 汽油 168種組分可以在110min內(nèi)一次進行分離測定 可以分析微量或痕量組分 如在大氣污染物分析中 甚至可測出ppt級的微量毒物 分析速度快 一般分析一次樣品的時間為幾分至幾十分鐘 某些快速分析 1秒可以分析7個組分 應用對象 氣體和液體 有機物和無機物 小分子和大分子等應用領域 醫(yī)藥 化工 環(huán)保 食品 農(nóng)藥 體育等 應用范圍廣 色譜流出曲線 根據(jù)色譜峰的個數(shù) 可以判斷樣品中所含組分的最少個數(shù) 根據(jù)色譜峰的保留值 可以進行定性分析 根據(jù)色譜峰的面積或峰高 可以進行定量分析 根據(jù)色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?可以評價色譜柱分離效能 根據(jù)色譜峰兩峰間的距離 可以評價固定相 或流動相 選擇是否合適 保留時間tR 進樣到出現(xiàn)色譜峰頂點的時間保留體積VR 進樣到出現(xiàn)色譜峰最大時消耗的流動相體積死時間t0 流動相流過色譜柱的時間死體積V0 色譜柱的空隙體積 校正保留時間 校正保留體積 保留值 基線 無組分通過色譜柱時 檢測器的噪音隨時間變化的曲線 峰寬Wb 色譜峰兩側拐點上的切線在基線上的截距半峰寬W1 2 峰高一半處對應的峰寬標準偏差 正常色譜峰的兩個拐點間距離的一半 18 相對保留值 選擇性因子 色譜法基本概念 固定相對兩種組分的選擇性 19 色譜法基本理論 不能分離 不能完全分離 能完全分離 峰之間的距離 分配系數(shù) 熱力學 峰的寬窄 柱效率 動力學 20 分配系數(shù)K 熱力學性質(zhì) 一定溫度下 組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度比 K只與固定相和被分離物質(zhì)的性質(zhì)有關 K值的差別是分離的先決條件 差別越大 分離的可能性越大 K值大的組分后出峰 分配比 容量因子 一定溫度與壓力下兩相達平衡后 組分在固定相和流動相量的比值 K與k的關系 容量因子k與保留值的關系 22 塔板理論 柱效能指標 塔板理論是色譜學中的熱力學平衡理論 它是把樣品組分在色譜柱中的分離過程 視為組分在分餾塔里的分餾過程 把色譜柱看成一個分餾塔 分餾塔利用各組分的沸點不同 在塔板上經(jīng)過多次氣 液平衡后 最終低沸點組分在塔頂流液的含量高 高沸點組分在塔低層含量高 而達到分離目的 石油裂解產(chǎn)物 23 塔板理論的基本假設 1 色譜中也存在類似分餾裝置的塔板 樣品中的某組分在色譜柱 H 的高度區(qū)間內(nèi)可以很快達到分配平衡 H稱為理論塔板高度 且組分在H高度內(nèi)服從分配定律 2 樣品各組分開始時存在于第0號塔板上 且試樣沿色譜柱軸 縱 向的擴散可以忽略不計 3 流動相進入色譜柱 洗脫過程 不是連續(xù)的 而是間歇進入 每次進入為一個塔板體積 4 分配系數(shù)在所有塔板上都相同 與組分在塔板上的量無關 24 塔板理論 柱效能指標 色譜柱長 L虛擬的塔板間距離 H色譜柱的理論塔板數(shù) n則三者的關系為 25 塔板理論 柱效能指標 理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關系 重點 tR 保留時間 W1 2 半峰寬 Wb 峰底寬 H 理論塔板高度 L 色譜柱長度 n 理論塔板數(shù) n有效 有效理論塔板數(shù) H有效 有效塔板高度 26 塔板數(shù)n是色譜柱的特征參數(shù) 當色譜柱長度一定時 塔板數(shù)n越大 塔板高度H越小 柱效能則越高 所得色譜峰越窄 不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同 用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時 應指明測定物質(zhì) 柱效不能表示被分離組分的實際分離效果 當兩組分的分配系數(shù)K相同時 無論該色譜柱的塔板數(shù)多大 都無法分離 塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實驗結果 也無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑 實際用用受到限制 塔板理論 幾點說明 塔板理論的不足 塔板理論雖然指出了理論板數(shù)n或理論板高度H對色譜柱效率的影響 但是沒有指出影響塔板高度的因素 因此無法在理論指導下從實驗上提高色譜柱的效率 28 速率理論 影響柱效能的因素 速率方程 也稱范 弟姆特方程式 H A B u C uH 理論塔板高度 u 載氣的線速度 cm s A 渦流擴散系數(shù) B 分子擴散系數(shù) C 傳質(zhì)阻力系數(shù) 29 A 2 dp指dp 固定相的平均顆粒直徑 固定相的填充不均勻因子 細而均勻的顆粒 填充的越均勻 A H 柱效n A 渦流擴散項 由于組分分子在色譜柱填充不均勻的固定相中移動途徑不同所造成的色譜峰展寬 30 B 2 Dg 彎曲因子 指填充柱內(nèi)流動相擴散路徑彎曲的因素 Dg 試樣組分分子在流動相的擴散系數(shù) cm2 s 1 流速 滯留時間 擴散 B u 分子擴散項 縱向擴散項 由于組分在液相中的擴散系數(shù)只有氣體中的1 105 因此在液相色譜中B可以忽略 由于組分在色譜柱中沿著柱長方向的擴散所致的濃度差而引起的色譜峰展寬 31 傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CLC Cg CL 擴散系數(shù)D C 分配平衡時間長 峰變寬 C u 傳質(zhì)阻力項 指組分在色譜柱流動相和固定相之間的傳遞過程 溶解或吸附等 存在不同的阻力而形成的色譜峰展寬 固定相傳質(zhì)阻力流動相傳質(zhì)阻力 q和 為與兩相的構型和性質(zhì)有關的常數(shù)dp和df為固定相顆粒直徑和固定液膜的厚度Ds為試樣分子在固定液的擴散系數(shù)Dm為試樣分子在流動相中的擴散系數(shù) 影響譜帶展寬柱外效應 進樣器死體積大 進樣量大 進樣速度慢 柱前后連接管道死體積大 檢測器死體積大 34 分離度 塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對的實際分離程度 即柱效為多大時 相鄰兩組份能夠被完全分離 難分離物質(zhì)對的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響 保留值之差 色譜過程的熱力學因素 區(qū)域?qū)挾?色譜過程的動力學因素 色譜分離中的四種情況如圖所示 柱效較高 K 分配系數(shù) 較大 完全分離 K不是很大 柱效較高 峰較窄 基本上完全分離 柱效較低 K較大 但分離的不好 K小 柱效低 分離效果更差 35 分離度的表達式 R 0 8 兩峰的分離程度可達89 R 1 分離程度98 R 1 5 達99 7 相鄰兩峰完全分離的標準 定義 相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值 36 分離度與基本色譜分離方程式 分離度R的定義并沒有反映影響分離度的各種因素 實際上 分離度是受柱效 n 選擇因子 和容量因子 k 三個參數(shù)的控制 上式即為基本色譜分離方程式 也可表示為 37 同理 可得 也可表示為 分離度與基本色譜分離方程式 38 提高分離度的途徑 1 1 提高柱效 1 增加柱長 n增加2倍時R只增大1 4倍 2 降低塔板高度H 是提高分離度的最好方法 39 分離度與柱效的關系 當固定相確定 被分離物質(zhì)對的 確定后 分離度將取決于n 這時 對于一定理論板高的柱子 分離度的平方與柱長成正比 即為了提高柱效 可采用的途徑 1 采用直徑較小 粒度均勻的固定相 2 控制較薄的液膜厚度 3 選擇適宜的流動相 流速和溫度等 40 提高分離度的途徑 2 增大容量因子kR隨k增大而增大 但是分析時間也隨之延長 為了增大k值 可采用的方法 1 GC 增加固定液的用量 適當降低柱溫 2 LC 適當采用極性較小一些的流動相 41 提高分離度的途徑 3 增大選擇性因子 值由于 的微小變化 都對R有很大的影響 增大 值是改善分離度的最有力的手段 為了增大 值 可采用的方法 1 GC 適當降低柱溫 2 LC 通過控制固定相和流動相的性質(zhì)來調(diào)整 存在的問題 的變化不像n和k有規(guī)律可循