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第39講　無菌操作技術實踐 [考綱要求]　1.微生物的分離和培養(yǎng)(B)。2.某種微生物數(shù)量的測定(C)。3.微生物的應用(B)。4.實驗：微生物的分離與培養(yǎng)(b)。 考點一　微生物的分離和培養(yǎng) 1．相關技能、技術和方法 (1)無菌操作的技能 ①干熱滅菌法是指將準備滅菌的物品放在干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下加熱1～2h以達到滅菌的目的。 ②濕熱滅菌法常采用高壓蒸汽滅菌鍋進行，其使用包括加水、裝鍋、加熱排氣、保溫保壓、出鍋等步驟。 (2)培養(yǎng)基的配制 ①培養(yǎng)基的概念：是為人工培養(yǎng)微生物而制備的適合微生物生長、繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。 ②營養(yǎng)組成：一般都含有水、碳源(提供碳元素的物質(zhì))、氮源(提供氮元素的物質(zhì))和無機鹽等最基本的物質(zhì)。此外，根據(jù)擬培養(yǎng)的微生物的不同需要，有時還要加入維生素等特殊的營養(yǎng)物質(zhì)，并要調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH使之滿足微生物生長的需要。 ③種類：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基，前者的主要優(yōu)點是取材便利、營養(yǎng)豐富、配制簡便，缺點是營養(yǎng)成分難以控制、實驗結果的重復性較差；后者的優(yōu)點是化學成分及其含量明確，實驗的可重復性好，缺點是配制繁瑣、成本較高。 (3)微生物的接種 ①接種：是指在無菌條件下將微生物接入培養(yǎng)基的操作過程。 ②常用的工具有玻璃涂布器、接種針、接種環(huán)等，在涂布平板接種時要用玻璃涂布器，穿刺接種時要用接種針，在斜面接種或在固體培養(yǎng)基平板上進行劃線接種時要用接種環(huán)。 2．大腸桿菌的接種與分離培養(yǎng) (1)配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 其操作步驟：配制培養(yǎng)基→調(diào)節(jié)pH→分裝→包扎→滅菌→擱置斜面。 (2)斜面接種和培養(yǎng)大腸桿菌 ①主要目的：菌種轉移、擴大培養(yǎng)和保存純凈菌種等。 ②主要步驟：準備接種→接種環(huán)滅菌→試管口滅菌→挑取少許菌種→劃線接種→在37℃恒溫箱中培養(yǎng)大腸桿菌24h→將增殖的菌種放置在冰箱的冷藏室中(4℃)保存。 (3)平板劃線分離和培養(yǎng)大腸桿菌 ①平板制作的方法及注意事項 a．請用文字和箭頭寫出正確的倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。 b．甲、乙、丙中的滅菌方法是灼燒滅菌。 c．丁中的操作需要等待平板冷卻凝固后才能進行。 ②平板劃線法是指用帶有微生物的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線而純化分離微生物的一種方法。 易混辨析　消毒和滅菌 項目 條件 結果 常用方法 應用范圍 消 毒 較為溫和的物理或化學方法 僅殺死物體表面或內(nèi)部的部分對人體有害的微生物 煮沸消毒法 日常用品 巴氏消毒法 不耐高溫的液體 化學藥劑消毒法 用酒精擦拭雙手，用氯氣消毒水源 滅 菌 強烈的理化因素 殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼燒滅菌法 接種工具 干熱滅菌法 玻璃器皿、 金屬用具等 高壓蒸汽 滅菌法 培養(yǎng)基及容 器的滅菌 (1)培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽，有時還需要加入一些特殊的物質(zhì)(　√　) (2)倒平板時，應將打開的皿蓋放到一邊，以免培養(yǎng)基濺到皿蓋上(　　) (3)消毒的原則是既殺死材料表面的微生物，又減少消毒劑對細胞的傷害(　√　) (4)為了防止污染，接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌后應趁熱快速挑取菌落(　　) (5)用涂布平板法純化大腸桿菌時，只要稀釋度足夠高，就能在培養(yǎng)基表面形成單個菌落(　√　) 如圖是采用純化微生物培養(yǎng)的兩種接種方法接種后培養(yǎng)的效果圖，請分析： (1)獲得圖A效果和圖B效果的接種方法分別是什么？ 提示　獲得效果A的接種方法為涂布平板法，獲得效果B的接種方法為平板劃線法。 (2)某同學在純化土壤中的細菌時，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上的菌落連成了一片，最可能的原因是什么？應當怎樣操作才可避免此種現(xiàn)象？ 提示　最可能的原因是菌液濃度過高或劃線時在劃下一區(qū)域前未將接種環(huán)灼燒滅菌；采取的措施是增大稀釋倍數(shù)或每次劃新區(qū)域前先將接種環(huán)灼燒滅菌。 (3)接種操作為什么一定要在火焰附近進行？ 提示　火焰附近存在著無菌區(qū)域。 命題點一　微生物的培養(yǎng)和無菌技術分析 1．(2018全國Ⅱ，37)在生產(chǎn)、生活和科研實踐中，經(jīng)常通過消毒和滅菌來避免雜菌的污染。回答下列問題： (1)在實驗室中，玻璃和金屬材質(zhì)的實驗器具________(填“可以”或“不可以”)放入干熱滅菌箱中進行干熱滅菌。 (2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高溫瞬時消毒法，與煮沸消毒法相比，這兩種方法的優(yōu)點是______________________________________________________________________。 (3)密閉空間內(nèi)的空氣可采用紫外線照射消毒，其原因是紫外線能________________。在照射前，適量噴灑________，可強化消毒效果。 (4)水廠供應的自來水通常是經(jīng)過________(填“氯氣”“乙醇”或“高錳酸鉀”)消毒的。 (5)某同學在使用高壓蒸汽滅菌鍋時，若壓力達到設定要求，而鍋內(nèi)并沒有達到相應溫度，最可能的原因是____________________________________。 答案　(1)可以　(2)在達到消毒目的的同時，營養(yǎng)物質(zhì)損失較少　(3)破壞DNA結構　消毒液　(4)氯氣(5)未將鍋內(nèi)冷空氣排盡 解析　(1)干熱滅菌是指將物品放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃條件下加熱1～2h。耐高溫、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)和金屬用具等，可采用干熱滅菌的方法。(2)巴氏消毒法是在70～75℃條件下煮30min或在80℃條件下煮15min，可以殺死牛奶中的微生物，并且使牛奶的營養(yǎng)物質(zhì)損失較少。(3)接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前，可以用紫外線照射30min，紫外線能破壞微生物的DNA結構，以殺死物體表面或空氣中的微生物。在照射前，適量噴灑石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以強化消毒效果。(4)自來水通常是用氯氣進行消毒的。(5)在使用高壓蒸汽滅菌鍋時，若壓力達到設定要求，而鍋內(nèi)并沒有達到相應溫度，最可能的原因是鍋內(nèi)原有的冷空氣沒有排盡。 2．高溫淀粉酶在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中有很大的實用性。研究者從熱泉中篩選出了能高效生產(chǎn)高溫淀粉酶的嗜熱菌，其篩選過程如下圖所示。請據(jù)圖回答下列問題： (1)Ⅰ號培養(yǎng)基從物理狀態(tài)來看，屬于固體培養(yǎng)基，配制時要加入________________作為凝固劑，從用途來看屬于選擇培養(yǎng)基，應以________________作為唯一碳源。 (2)配制固體培養(yǎng)基的基本步驟是(　　) A．計算、稱量、倒平板、溶化、滅菌 B．計算、稱量、溶化、倒平板、滅菌 C．計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板 D．計算、稱量、滅菌、溶化、倒平板 (3)溶化時，燒杯中加入瓊脂后要不停地____________，防止瓊脂糊底引起燒杯破裂。對培養(yǎng)基滅菌的方法一般為____________________。 (4)過程①是________________，過程②所使用的接種方法是________________法。 (5)部分嗜熱菌在Ⅰ號培養(yǎng)基上生長時可釋放________分解培養(yǎng)基中的淀粉，在菌落周圍形成透明圈，挑選相應的菌落，接種到Ⅱ號培養(yǎng)基進一步分離純化后，再對菌種進行________________培養(yǎng)。 答案　(1)瓊脂　淀粉　(2)C　(3)攪拌　高壓蒸汽滅菌(4)稀釋　涂布平板　(5)淀粉酶　擴大 解析　(1)固體培養(yǎng)基中通常加入瓊脂作為凝固劑。本實驗的目的是獲得生產(chǎn)高溫淀粉酶的嗜熱菌，故其選擇培養(yǎng)基中應以淀粉作為唯一碳源。(2)配制固體培養(yǎng)基的基本步驟是計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。(3)配制培養(yǎng)基加熱溶化時，要注意加入瓊脂后要不斷攪拌，防止瓊脂糊底。對培養(yǎng)基的滅菌一般采用高壓蒸汽滅菌法。(4)仔細觀察題圖可知，過程①是菌液稀釋，過程②是采用涂布平板法接種。(5)能產(chǎn)生淀粉酶的部分細菌能分解利用淀粉，其菌落周圍會出現(xiàn)透明圈，取這樣的菌落再分離純化可獲得相應菌種，以后可以對菌種進行擴大培養(yǎng)用于生產(chǎn)。 科學探究　(1)培養(yǎng)基的配制原則 ①目的要明確：配制時應根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制的培養(yǎng)基種類。 ②營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例。 ③pH要適宜：細菌為6.5～7.5，放線菌為7.5～8.5，真菌為5.0～6.0，培養(yǎng)不同微生物所需的pH不同。 (2)微生物對主要營養(yǎng)物質(zhì)的需求特點 ①自養(yǎng)型微生物所需的主要營養(yǎng)物質(zhì)是無機鹽，碳源可來自大氣中的CO2，氮源可由含氮無機鹽提供。 ②異養(yǎng)型微生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)主要是有機物，即碳源必須由含碳有機物提供，氮源也主要是由有機物提供，部分異養(yǎng)型微生物也可以利用無機氮源。 命題點二　微生物的純化方法及過程分析 3．(2018全國Ⅲ，37)回答下列與酵母菌有關的問題： (1)分離培養(yǎng)酵母菌通常使用____________(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麥芽汁瓊脂”)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基應采用________滅菌法滅菌。若將酵母菌劃線接種在平板上，培養(yǎng)一段時間后可觀察到菌落，菌落的含義是_________________________________________________。 (2)酵母菌液體培養(yǎng)時，若通入氧氣，可促進________________(填“菌體快速增殖”“乙醇產(chǎn)生”或“乳酸產(chǎn)生”)；若進行厭氧培養(yǎng)，可促進____________(填“菌體快速增殖”“乙醇產(chǎn)生”或“乳酸產(chǎn)生”)。 (3)制作面包時，為使面包松軟通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松軟的原因是___________________________________________________________________。 答案　(1)麥芽汁瓊脂　高壓蒸汽　由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體　(2)菌體快速增殖　乙醇產(chǎn)生　(3)酵母菌分解葡萄糖會產(chǎn)生CO2，CO2使面包松軟 解析　(1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用廣泛的細菌培養(yǎng)基；MS培養(yǎng)基是滿足植物細胞的營養(yǎng)和生理需要的培養(yǎng)基；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基通常用于酵母菌(真菌)的培養(yǎng)、鑒定及菌種保存。培養(yǎng)基的滅菌方法為高壓蒸汽滅菌法。菌落是指由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體。(2)酵母菌為兼性厭氧型微生物，在有氧條件下進行有氧呼吸為其自身的繁殖提供能量；在無氧條件下，酵母菌進行無氧呼吸產(chǎn)生乙醇。(3)面包松軟是因為制作過程中加入的酵母菌可以分解葡萄糖產(chǎn)生大量的CO2，CO2遇熱膨脹，使得制作的面包松軟多孔。 4．牛奶是微生物培養(yǎng)的良好培養(yǎng)基，牛奶在飲用前都要經(jīng)過巴氏消毒，以殺死有害微生物，為檢測消毒前后牛奶中細菌含量變化情況，做如圖1所示操作。用無菌吸管從錐形瓶中吸取1mL生牛奶稀釋液至盛有9mL無菌水的試管中，混合均勻，如此再重復2次。請回答下列有關問題： (1)巴氏消毒的方法是____________________________，使用這種方法對生鮮牛奶進行消毒的好處是__________________________________。 (2)取最終的牛奶稀釋液0.1mL滴在培養(yǎng)基上進行涂布，應選擇的涂布工具是圖2中的__________________。 (3)圖1中所示方法為稀釋涂布平板法，理想情況下，培養(yǎng)一段時間后可在培養(yǎng)基表面形成菌落。若用該方法培養(yǎng)設置了3個培養(yǎng)皿，菌落數(shù)分別為35個、33個、34個，則可以推測生牛奶中每毫升含細菌數(shù)為__________個，運用這種方法統(tǒng)計的結果往往較實際值______________(填“偏大”或“偏小”)，原因是________________________________。 (4)消毒后的牛奶中絕大部分細菌被殺死，若繼續(xù)用該方法檢測消毒后的牛奶中細菌的數(shù)量，則在操作步驟上應做什么改動？__________________。 (5)從生牛奶取樣培養(yǎng)得到的菌落中混有各種雜菌，從中檢測出大腸桿菌的方法是在培養(yǎng)基中加入__________，若菌落具有____________特征，則可以認定為大腸桿菌。 答案　(1)在70～75℃煮30min(或在80℃煮15min)　牛奶的營養(yǎng)成分不被破壞　(2)B　(3)3.4106　偏小　個別菌落可能是由兩個或多個細胞形成的　(4)減少稀釋次數(shù)　(5)伊紅美藍　(金屬光澤的紫)黑色 解析　(1)巴氏消毒的方法是在70～75℃煮30min或在80℃煮15min，可以殺死牛奶中的微生物，并且使牛奶的營養(yǎng)成分不被破壞。(2)涂布使用的工具是涂布器，圖2中B正確。(3)菌落的平均數(shù)是34個，生牛奶中每毫升含細菌數(shù)＝菌落平均數(shù)/涂布量稀釋倍數(shù)＝34個/0.1 mL104＝3.4106個/mL。在統(tǒng)計菌落時，當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是單個菌落，所以運用這種方法統(tǒng)計的結果往往比實際值偏小。(4)由于消毒后牛奶中絕大部分細菌被殺死，所以可減少稀釋次數(shù)。(5)大腸桿菌的代謝產(chǎn)物會使伊紅美藍鑒別培養(yǎng)基出現(xiàn)金屬光澤的紫黑色。 考點二　分離特定的微生物并測定其數(shù)量 1．區(qū)分涂布平板法和混合平板法 (1)過程如圖 (2)結果不同 ①涂布平板法：細菌菌落通常僅在平板表面生長。 ②混合平板法：細菌菌落出現(xiàn)在平板表面及內(nèi)部。 (3)目的相同：分離各種目的微生物。 2．選擇培養(yǎng)分離 (1)方法：針對某種微生物的特性，設計一個特定的環(huán)境，使之特別適合這種微生物的生長，而抑制其他微生物的生長。 (2)原理：不同微生物有不同的營養(yǎng)需求或對某種化學物質(zhì)有不同的敏感性。 (3)用途：從眾多微生物中分離出特定的微生物。 3．菌落 (1)概念：單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度，形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結構的子細胞生長群體。 (2)特征：不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落一般都具有穩(wěn)定的特征，如菌落的大小、形狀、邊緣特征、隆起程度、顏色等，這些可以作為對微生物進行分類、鑒定的重要依據(jù)。 4．土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù) (1)分離原理：土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶，這種物質(zhì)在把尿素分解成無機物的過程中起到催化作用。 (2)統(tǒng)計菌落數(shù)目一般用涂布平板法。 ①統(tǒng)計菌落數(shù)目時，培養(yǎng)基表面生長的1個菌落，來源于樣品稀釋液中1個活菌。為了保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)。 ②從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)的計算方法是(平均菌落數(shù)涂布的稀釋液體積)稀釋倍數(shù)。 ③利用涂布平板法成功統(tǒng)計菌落數(shù)目的關鍵是恰當?shù)南♂尪取? (3)實驗流程：土壤取樣→樣品的稀釋→微生物的培養(yǎng)與觀察→細菌的計數(shù)。 5．分解纖維素的微生物的分離 (1)土壤中能分解纖維素的微生物種類很多，有細菌、真菌等，它們能分泌纖維素酶，將纖維素分解成小分子糖類物質(zhì)以滿足自身生命活動的需要，同時也能改善土壤的結構，提高土壤的肥力。 (2)纖維素分解菌的篩選 ①原理 　　　　　　　　纖維素分解菌 　　　　　　　　　　　↓ →紅色復合物紅色消失，出現(xiàn)透明圈 ②篩選方法：剛果紅染色法，即通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。 ③培養(yǎng)基：以纖維素為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基。 ④實驗流程 土壤取樣：富含纖維素的環(huán)境 ↓ 選擇培養(yǎng)：用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，以增加纖維素分解菌的濃度 ↓ 梯度稀釋：制備系列稀釋液 ↓ 涂布平板：將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上 ↓ 挑選產(chǎn)生透明圈的菌落 6．顯微鏡直接計數(shù)法 (1)原理：利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量。 (2)缺點：不能區(qū)分死菌還是活菌。 (3)1mL培養(yǎng)液中菌體的總數(shù)換算公式為： ①1625型的血球計數(shù)板：1mL懸液中待測標本(菌體)數(shù)＝400104稀釋倍數(shù)。 ②2516型的血球計數(shù)板：1mL懸液中待測標本(菌體)數(shù)＝400104稀釋倍數(shù)。 (1)選擇培養(yǎng)基可以鑒定某種微生物的種類(　　) (2)對細菌進行計數(shù)只能采用涂布平板法，而不能用平板劃線法(　　) (3)篩選能分解尿素的細菌所利用的培養(yǎng)基中，尿素是唯一的氮源(　√　) (4)分解尿素的細菌在分解尿素時，可以將尿素轉化為氨，使得培養(yǎng)基的酸堿度降低(　　) (5)剛果紅可以與纖維素形成透明復合物，所以可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌(　　) 研究人員在剛果紅培養(yǎng)基平板上，篩選到了幾株有透明降解圈的菌落如圖1所示，將篩選到的纖維素酶高產(chǎn)菌株J1和J4在不同的溫度和pH條件下進行發(fā)酵，測得發(fā)酵液中酶活性的結果如圖2，請分析： (1)透明圈是如何形成的？ 提示　剛果紅可以與纖維素形成紅色復合物，但并不與纖維素降解產(chǎn)物發(fā)生這種反應。細菌分泌的纖維素酶能將培養(yǎng)基中的纖維素降解，形成透明圈。 (2)圖中透明圈大小代表什么？降解纖維素能力最強的菌株是哪種？ 提示　透明圈大小與纖維素酶的量和活性有關，降解纖維素能力最強的是菌株①。 (3)結合圖2推測哪種菌株更適合用于人工瘤胃發(fā)酵？ 提示　J4菌株在較高溫度和酸性環(huán)境下酶的活性更高，更適合用于人工瘤胃發(fā)酵。 1．選擇培養(yǎng)基的制作思路 (1)在培養(yǎng)基全部營養(yǎng)成分具備的前提下，加入物質(zhì)：如培養(yǎng)基中加入高濃度食鹽時可抑制多種細菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長，從而可將該菌分離出來；在培養(yǎng)基中加入青霉素時可抑制細菌、放線菌的生長，但不影響酵母菌和霉菌的生長，從而可將這兩種菌分離出來。 (2)通過改變培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分達到分離微生物的目的：培養(yǎng)基中缺乏氮源時，可分離自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而無法生存；培養(yǎng)基中缺乏有機碳源時，自養(yǎng)微生物可利用空氣中的CO2制造有機物生存，而異養(yǎng)微生物則無法生存。 (3)利用培養(yǎng)基的特定化學成分分離特定微生物：如當石油是唯一碳源時，可抑制不能利用石油的微生物生長，使能夠利用石油的微生物生長，從而分離出能消除石油污染的微生物。 (4)通過某些特殊環(huán)境分離微生物：如在高鹽環(huán)境中可分離耐鹽菌，其他菌在鹽濃度較高時易失水而不能生存；在高溫環(huán)境中可分離得到耐高溫的微生物，其他微生物在高溫環(huán)境中因酶失活而無法生存。 2．兩種純化細菌方法的辨析 比較項目 平板劃線法 涂布平板法 關鍵操作 接種環(huán)在固體平板培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線 ①一系列的梯度稀釋 ②涂布平板法操作 注意事項 每次劃線前后均需灼燒接種環(huán) 稀釋度要足夠高，為確保實驗成功可以適當增加稀釋度的范圍 菌體獲取 在具有顯著菌落特征的區(qū)域的菌落中挑取菌體 從適宜稀釋度的平板上的菌落中挑取菌體 優(yōu)點 可以根據(jù)菌落的特點獲得某種微生物的單細胞菌落 既可以獲得單細胞菌落，又能對微生物進行計數(shù) 缺點 不能對微生物計數(shù) 操作復雜，需要涂布多個平板  命題點一　選擇培養(yǎng)基成分及配制方法的分析 1．(2018全國Ⅰ，37)將馬鈴薯去皮切塊，加水煮沸一定時間，過濾得到馬鈴薯浸出液。在馬鈴薯浸出液中加入一定量蔗糖和瓊脂，用水定容后滅菌，得到M培養(yǎng)基?；卮鹣铝袉栴}： (1)M培養(yǎng)基若用于真菌的篩選，則培養(yǎng)基中應加入鏈霉素以抑制________的生長，加入了鏈霉素的培養(yǎng)基屬于________培養(yǎng)基。 (2)M培養(yǎng)基中的馬鈴薯浸出液為微生物生長提供了多種營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)物質(zhì)類型除氮源外還有______________________(答出兩點即可)。氮源進入細胞后，可參與合成的生物大分子有_______________________(答出兩點即可)。 (3)若在M培養(yǎng)基中用淀粉取代蔗糖，接種土壤濾液并培養(yǎng)，平板上長出菌落后可通過加入顯色劑篩選出能產(chǎn)淀粉酶的微生物。加入的顯色劑是________，該方法能篩選出產(chǎn)淀粉酶微生物的原理是___________________________________________________________________。 (4)甲、乙兩位同學用涂布平板法測定某一土壤樣品中微生物的數(shù)量，在同一稀釋倍數(shù)下得到以下結果： 甲同學涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是110、140和149，取平均值133； 乙同學涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是27、169和176，取平均值124。 有人認為這兩位同學的結果中，乙同學的結果可信度低，其原因是________________________ __________________________________________________________。 答案　(1)細菌　選擇　(2)碳源、無機鹽　蛋白質(zhì)、核酸 (3)稀碘液　淀粉遇稀碘液顯藍色，產(chǎn)淀粉酶的菌落周圍淀粉被水解，形成透明圈　(4)乙同學的結果中，1個平板的計數(shù)結果與另2個相差懸殊，結果的重復性差 解析　(1)鏈霉素是抗生素，可抑制細菌生長，故在M培養(yǎng)基中加入鏈霉素作為選擇培養(yǎng)基，可篩選出真菌。(2)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分一般包括碳源、氮源、水和無機鹽等。細胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白質(zhì)、核酸等，故所加入的氮源可參與以上物質(zhì)的合成。(3)淀粉遇碘變藍，向加有淀粉的培養(yǎng)基中加入稀碘液后培養(yǎng)基呈現(xiàn)藍色，產(chǎn)淀粉酶的菌落周圍的淀粉被水解，形成透明圈，可根據(jù)透明圈的大小判斷產(chǎn)生淀粉酶的多少。(4)統(tǒng)計菌落數(shù)時一般選擇菌落數(shù)在30～300個的平板，甲同學統(tǒng)計的3個平板中的菌落數(shù)在正常范圍內(nèi)且差距不大，比較準確；乙同學統(tǒng)計的3個平板中，1個平板的計數(shù)結果與另2個相差懸殊，結果的重復性差。 2．苯酚是工業(yè)生產(chǎn)排放的有毒污染物質(zhì)，自然界中存在著降解苯酚的微生物。某工廠產(chǎn)生的廢水中含有苯酚，為了降解廢水中的苯酚，研究人員從土壤中篩選獲得了只能降解利用苯酚的細菌菌株，篩選的主要步驟如圖所示，①為土壤樣品。請據(jù)圖回答下列問題： (1)②中培養(yǎng)目的菌株的選擇培養(yǎng)基中應加入________作為碳源，②中不同濃度碳源的培養(yǎng)基______________(填“影響”或“不影響”)細菌的數(shù)量，如果要測定②中活細菌數(shù)量，常采用______________________法。 (2)④為對照，微生物在④中不生長，在⑤中生長，④與⑤培養(yǎng)基的主要區(qū)別在于____________ ______________________________________________________________________。 采用固體平板培養(yǎng)細菌時進行倒置培養(yǎng)的原因是_____________________________________ __________________________________________________________。 (3)實驗過程中如何防止其他微生物的污染？ ________________________________________________________________________。 答案　(1)苯酚　影響　涂布平板菌落計數(shù)　(2)④的培養(yǎng)基中沒有加入苯酚作為碳源，⑤的培養(yǎng)基中加入了苯酚作為碳源　防止冷凝后形成的水珠滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基　(3)培養(yǎng)基滅菌，接種環(huán)境滅菌，接種過程進行無菌操作 解析　(1)選擇只能降解利用苯酚的細菌的培養(yǎng)基是以苯酚為唯一碳源的培養(yǎng)基；苯酚是唯一的碳源，當苯酚消耗盡時，菌株因缺少碳源而不能繼續(xù)繁殖，所以②中不同濃度的碳源會影響細菌數(shù)量；一般采用涂布平板菌落計數(shù)法來測定②中活菌數(shù)目。(2)④與⑤培養(yǎng)基的主要區(qū)別在于④的培養(yǎng)基中沒有加入苯酚作為碳源，⑤的培養(yǎng)基中加入了苯酚作為碳源；采用固體平板培養(yǎng)細菌時要倒置培養(yǎng)，以防止冷凝后形成的水珠滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基。(3)從制備培養(yǎng)基到接種與培養(yǎng)等全部實驗過程要進行無菌操作。無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是防止外來雜菌的入侵：a.實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；b.將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌；c.為避免周圍環(huán)境中微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行；d.實驗操作時應避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。 命題點二　微生物分離與計數(shù)的實例分析 3．(2018山東、湖北部分重點中學高考沖刺模擬)從土壤中分離尿素分解菌和纖維素分解菌，具有下列類似的操作過程： (1)在過程④的選擇培養(yǎng)基是________培養(yǎng)基(填“固體”或“液體”)，過程⑧的選擇培養(yǎng)基是________培養(yǎng)基(填“固體”或“液體”)。④的具體操作是________________；⑧的具體操作是________________________________________________________________________。 (2)在過程③樣品梯度稀釋后，一般只將稀釋度為104～106倍的菌液分別接種到3個平板培養(yǎng)基上。接種的常用方法為____________________________。 (3)過程⑩采用______________________的鑒別方法較簡單。周圍出現(xiàn)透明圈但不能100%確定為纖維素分解菌的菌落，原因是_____________________________________________。 答案　(1)固體　液體　以尿素為唯一氮源　以纖維素為唯一碳源　(2)涂布平板(或平板劃線)法　(3)倒平板時加入剛果紅染液　不分解纖維素(如分解剛果紅)的微生物菌落也可能出現(xiàn)透明圈 解析　(1)將微生物接種在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，才能形成菌落，可見，過程④的選擇培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基。進行梯度稀釋并接種前要進行過程⑧所示的選擇培養(yǎng)，因此過程⑧的選擇培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基。④選擇培養(yǎng)的目的是篩選尿素分解菌，所以具體的操作是以尿素為唯一氮源；⑧選擇培養(yǎng)的目的是篩選纖維素分解菌，所以⑧的具體操作是以纖維素為唯一碳源。 (2)常采用涂布平板(或平板劃線)法將稀釋度為104～106倍的菌液分別接種到3個平板培養(yǎng)基上。(3)剛果紅可與纖維素形成紅色復合物，但并不和纖維素水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生顏色反應。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅—纖維素的復合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈?？梢姡^程⑩采用倒平板時加入剛果紅染液的鑒別方法較簡單。由于不分解纖維素(如分解剛果紅)的微生物菌落也可能出現(xiàn)透明圈，所以周圍出現(xiàn)透明圈的菌落，不能100%確定為纖維素分解菌的菌落。 4．(2018通州高三第二次診斷)北方每年在小麥豐收的季節(jié)，焚燒秸稈火焰四起，煙霧彌漫，不但導致嚴重的霧霾而且造成資源的浪費?？茖W家為了解決這個問題，努力尋找分解秸稈中纖維素的微生物，他們做了如下實驗，據(jù)圖回答： →→→ → 甲 (1)根據(jù)甲圖，選擇培養(yǎng)纖維素分解菌要用__________。為了統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目，常用方法除涂布平板法外，還有______________________的方法。 (2)乙圖是培養(yǎng)出的單菌落示意圖，最適合分解秸稈的兩個菌落是____________(填數(shù)字)，纖維素分解菌將纖維素最終分解為____________。從圖中可以看出培養(yǎng)基上菌落數(shù)較少，推測可能的原因是____________________________________________________________。 (3)為了長期保存該微生物，可以采用______________的方法。 答案　(1)選擇培養(yǎng)基　顯微鏡直接計數(shù)　(2)1和4　葡萄糖　土壤中纖維素分解菌較少，稀釋的倍數(shù)太大　(3)甘油管藏 解析　(1)從土壤樣液中篩選能分解纖維素的細菌所用的培養(yǎng)基是選擇培養(yǎng)基。統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目，常用涂布平板法或顯微鏡直接計數(shù)的方法。(2)透明圈的大小反映了細菌分解纖維素的能力大小，所以乙圖中最適合分解秸稈的兩個菌落是1和4；纖維素是多糖，最終被纖維素分解菌分解成葡萄糖；從圖中可以看出培養(yǎng)基上菌落數(shù)較少，推測可能是土壤中纖維素分解菌較少，稀釋的倍數(shù)太大所致。(3)長期保留菌種可用甘油管藏的方法。 矯正易錯　強記長句 1．灼燒接種環(huán)，待其冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。 2．劃線時最后一區(qū)不要與第一區(qū)相連。 3．劃線時用力大小要適當，這是為了防止用力過大將培養(yǎng)基劃破。 4．用涂布平板菌落計數(shù)法統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。 5．尿素分解菌和纖維素分解菌的分離都運用了選擇培養(yǎng)基，前者所用的培養(yǎng)基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培養(yǎng)基中纖維素是唯一的碳源。 下圖甲、乙是微生物接種常用的兩種方法，請回答相關問題： 1．圖甲是利用平板劃線法進行微生物接種，圖乙是利用涂布平板法進行微生物接種。對這兩種接種工具進行滅菌和消毒的方法依次是灼燒滅菌和酒精消毒。 2．接種操作在火焰附近進行的原因是火焰附近為無菌區(qū)域。 3．接種后，在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)細菌時進行倒置培養(yǎng)的目的是防止冷凝后形成的水珠滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基 重溫高考　演練模擬 1．(2016江蘇，25)漆酶屬于木質(zhì)素降解酶類，在環(huán)境修復、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領域有著廣泛用途。下圖是分離、純化和保存漆酶菌株的過程，相關敘述正確的是(多選)(　　) A．生活污水中含有大量微生物，是分離產(chǎn)漆酶菌株的首選樣品 B．篩選培養(yǎng)基中需要加入漆酶的底物，通過菌落特征挑出產(chǎn)漆酶的菌落 C．在涂布平板上長出的菌落，再通過劃線進一步純化 D．斜面培養(yǎng)基中含有大量營養(yǎng)物，可在常溫下長期保存菌株 答案　BC 解析　漆酶降解“木質(zhì)”，則漆酶菌株多存在于“木質(zhì)”豐富的場所，生活污水中含有大量微生物，但不一定含有產(chǎn)漆酶的菌株，A錯誤；產(chǎn)漆酶菌株可降解木質(zhì)素，在篩選培養(yǎng)基中加入木質(zhì)素可篩選產(chǎn)漆酶的菌株，篩選時可通過菌落特征挑出產(chǎn)漆酶的菌落，B正確；在涂布平板上長出的菌落，再通過劃線進一步純化，C正確；斜面培養(yǎng)基中含有大量營養(yǎng)物，可在低溫下長期保存菌株，D錯誤。 2．(2018江蘇，31)酵母的蛋白質(zhì)含量可達自身干重的一半，可作為飼料蛋白的來源。有些酵母可以利用工業(yè)廢甲醇作為碳源進行培養(yǎng)，這樣既可減少污染又可降低生產(chǎn)成本。研究人員擬從土壤樣品中分離該類酵母，并進行大量培養(yǎng)。下圖所示為操作流程，請回答下列問題： (1)配制培養(yǎng)基時，按照培養(yǎng)基配方準確稱量各組分，將其溶解、定容后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的________，及時對培養(yǎng)基進行分裝，并進行____________滅菌。 (2)取步驟②中不同梯度的稀釋液加入標記好的無菌培養(yǎng)皿中，在步驟③中將溫度約________(在25℃、50℃或80℃中選擇)的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿混勻，冷凝后倒置培養(yǎng)。 (3)挑取分離平板中長出的單菌落，按步驟④所示進行劃線。下列敘述合理的有____________。 a．為保證無菌操作，接種針、接種環(huán)使用前都必須滅菌 b．劃線時應避免劃破培養(yǎng)基表面，以免不能形成正常菌落 c．挑取菌落時，應挑取多個菌落，分別測定酵母細胞中甲醇的含量 d．可以通過逐步提高培養(yǎng)基中的甲醇的濃度，獲得甲醇高耐受株 (4)步驟⑤中，為使酵母數(shù)量迅速增加，培養(yǎng)過程中需保證充足的營養(yǎng)和________供應。為監(jiān)測酵母的活細胞密度，將發(fā)酵液稀釋1000倍后，經(jīng)等體積臺盼藍染液染色，用2516型血細胞計數(shù)板計數(shù)5個中格中的細胞數(shù)，理論上________色細胞的個數(shù)應不少于________，才能達到每毫升3109個活細胞的預期密度。 答案　(1)pH　高壓蒸汽(濕熱)　(2)50℃　(3)a、b、d(4)氧氣　無　30 解析　(1)配制培養(yǎng)基時，進行計算、稱量、溶化、定容后，需先調(diào)pH再分裝到錐形瓶中進行高壓蒸汽滅菌。(2)倒平板時的培養(yǎng)基溫度約為50℃，冷凝后倒置培養(yǎng)。(3)平板劃線時，接種針、接種環(huán)使用前和每次劃線后都需要進行灼燒滅菌，以免造成雜菌污染，a正確；劃線時不能劃破培養(yǎng)基表面，否則不能形成正常菌落，b正確；挑取菌落時，應挑取多個不同的菌落，分別測定酵母細胞中蛋白質(zhì)含量，c錯誤；逐步提高培養(yǎng)基中甲醇的濃度，能篩選出其中的耐受菌，獲得甲醇高耐受菌株，d正確。(4)酵母是兼性厭氧型真菌，在有氧條件下可大量繁殖。酵母擴大培養(yǎng)時，需保證充足的營養(yǎng)和氧氣等條件。由題中信息“經(jīng)等體積臺盼藍染液染色”可知，計數(shù)室中培養(yǎng)液容積實際只有0.12＝0.05mm3。設5個中方格中無色(活細胞不能被臺盼藍染色)的細胞數(shù)目為x個，則3109＝x/525100010000.05，解得x＝30(個)。 3．(2017江蘇，31)苯酚及其衍生物廣泛存在于工業(yè)廢水中，對環(huán)境有嚴重危害。小明同學準備依據(jù)下圖操作步驟，從處理廢水的活性污泥中分離篩選酚降解高效菌株。請回答下列問題： (1)酚降解菌富集培養(yǎng)基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作為碳源的有________________________________________________________________________。 (2)將采集到的樣品接種培養(yǎng)，苯酚用量應隨轉接次數(shù)增加而逐漸________，以達到富集酚降解菌的目的。若上圖平板中菌落過于密集，應進一步________，以便于菌落計數(shù)與分離。制備平板培養(yǎng)基時除了需要水、營養(yǎng)物質(zhì)外，還必須添加________。 (3)如圖為連續(xù)劃線法示意圖，在圖中________(填圖中序號)區(qū)域更易獲得單菌落。 (4)采用比色測定法(使用苯酚顯色劑)檢測降解后的廢水中苯酚殘留量。先制作系列濃度梯度并進行顯色反應，下表中1～5號比色管的苯酚濃度應分別為____________________。 管號 1 2 3 4 5 6 苯酚濃度(mg/L) 1 如果廢水為50mg/L苯酚溶液，降解后約有21%的苯酚殘留，則需將殘留液稀釋________(填序號：①5?、?0?、?0)倍后，再進行比色。 答案　(1)蛋白胨、苯酚　(2)增加　稀釋涂布　凝固劑(3)③　(4)0、0.2、0.4、0.6、0.8?、? 解析　(1)含碳有機物如蛋白胨、苯酚均可作為異養(yǎng)型細菌的碳源。 (2)為達到富集苯酚降解菌的目的，培養(yǎng)過程中隨轉接次數(shù)增加，應逐漸提高苯酚用量。若平板中菌落過于密集，為便于分離計數(shù)，則應進一步稀釋涂布；進行分離計數(shù)應制備“固體”培養(yǎng)基，故平板培養(yǎng)基中除需水、營養(yǎng)物質(zhì)外，還需添加凝固劑。 (3)連續(xù)劃線法分離菌種時，在最后的劃線區(qū)，菌種分散最充分，最宜獲得單菌落。 (4)制作系列濃度梯度進行顯色反應應設置無菌水作對照組(苯酚濃度為0)，并設置等差密度梯度，故1～5號比色管的苯酚濃度依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8。若廢水為50mg/L苯酚溶液，降解后約有21%的苯酚殘留，則殘留液中苯酚濃度為10.5 mg/L，宜將其稀釋20倍方可達到適宜比色管苯酚濃度。 一、選擇題 1．(2018蘇州高三一模)下列有關微生物培養(yǎng)的敘述正確的是(　　) A．通常使用液體培養(yǎng)基分離獲得細菌單菌落 B．若培養(yǎng)基需要調(diào)節(jié)pH，應該在滅菌后進行 C．用顯微鏡直接計數(shù)固體培養(yǎng)基中微生物數(shù)量 D．倒置平板可防止培養(yǎng)基被滴落的冷凝水污染 答案　D 解析　常用固體或半固體培養(yǎng)基分離獲得細菌單菌落，液體培養(yǎng)基無法分離，A錯誤；若培養(yǎng)基需要調(diào)節(jié)pH，應該在滅菌前進行，B錯誤；顯微鏡直接計數(shù)法是測定培養(yǎng)液中微生物數(shù)量的方法，固體培養(yǎng)基上用涂布平板法直接計數(shù)單個菌落數(shù)，C錯誤；倒置平板是防止冷凝后形成的水珠滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基，D正確。 2．下面是微生物平板劃線示意圖，劃線的順序為1、2、3、4、5。下列敘述正確的是(　　) A．在五個區(qū)域中劃線前后都要對接種環(huán)和培養(yǎng)基進行滅菌 B．劃線操作時完全打開皿蓋，劃完立即蓋上 C．接種時不能劃破培養(yǎng)基，否則難以達到分離單菌落的目的 D．第1區(qū)和第5區(qū)的劃線最終要連接起來，以便比較前后的菌落數(shù) 答案　C 解析　在每次劃線前后都要對接種環(huán)進行滅菌，但不能對培養(yǎng)基進行滅菌，A錯誤；進行劃線操作時，左手將培養(yǎng)皿的皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋，B錯誤；注意接種時不能劃破培養(yǎng)基，否則難以達到分離單菌落的目的，C正確；第1區(qū)和第5區(qū)的劃線不能相連，D錯誤。 3．給無氮培養(yǎng)基接種土壤稀泥漿的正確方法是(　　) A．打開培養(yǎng)皿蓋，取一根接種環(huán)沾取少許稀泥漿，輕輕地點接在培養(yǎng)基的表面上 B．取一根接種環(huán)在酒精燈的火焰上滅菌后沾取少許稀泥漿，略微打開培養(yǎng)皿蓋，在培養(yǎng)基的表面輕點 C．打開培養(yǎng)皿蓋，取一根接種環(huán)在酒精燈的火焰上滅菌后沾取少許稀泥漿，在培養(yǎng)基的表面輕點 D．略微打開培養(yǎng)皿蓋，取一根接種環(huán)在酒精燈的火焰上滅菌，冷卻后沾取少許稀泥漿，在培養(yǎng)基的表面輕點 答案　D 解析　接種過程中要防止外來雜菌的入侵，左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，右手將接種環(huán)在火焰上滅菌，冷卻后沾取少許稀泥漿，在培養(yǎng)基的表面輕點，用未冷卻的接種環(huán)沾取稀泥漿會殺滅菌種。 4．(2019吉林模擬)下面關于土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)的敘述中，正確的是(　　) A．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 B．篩選分解尿素的細菌時，應以尿素作為培養(yǎng)基中唯一的營養(yǎng)物質(zhì) C．統(tǒng)計樣品中的活菌數(shù)目一般用平板劃線法 D．在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變藍，則表明篩選到了分解尿素的細菌 答案　A 解析　只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，A項正確；篩選分解尿素的細菌的實驗中，采用的是以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基，B項錯誤；統(tǒng)計樣品中的活菌數(shù)目一般用涂布平板法，C項錯誤；在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細菌后，如果pH升高，指示劑變紅，這樣就能初步鑒定該種細菌能夠分解尿素，D項錯誤。 5．細菌需要從外界吸收營養(yǎng)物質(zhì)并通過代謝來維持正常的生長和繁殖。下列與此有關的說法錯誤的是(多選)(　　) A．乳酸菌與硝化細菌所利用的碳源物質(zhì)是相同的 B．無機氮源不可能作為細菌的能源物質(zhì) C．瓊脂是細菌生長和繁殖中不可缺少的一種物質(zhì) D．以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基上長出的不都是尿素分解菌 答案　ABC 解析　乳酸菌是異養(yǎng)型微生物，需要有機碳源，而硝化細菌是自養(yǎng)型微生物，需要的碳源是CO2，故A項錯誤；有些無機氮源也可以提供能量，如硝化細菌可以利用氧化氨釋放的能量進行有機物的合成，故B項錯誤；培養(yǎng)基中的瓊脂是凝固劑，不會被微生物利用，故C項錯誤；自生固氮微生物可以利用大氣中的N2作為氮源，因此以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基上長出的不都是尿素分解菌，故D項正確。 二、非選擇題 6．在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)研究上，常需要進行微生物的分離和計數(shù)。 (1)下表為兩種微生物的培養(yǎng)基配方： A組 KH2PO4 Na2HPO4 MgSO47H2O 葡萄糖 尿素 瓊脂 1.4g 2.1g 0.2g 10.0g 1.0g 15.0g B組 纖維 素粉 NaNO3 Na2HPO47H2O KH2PO4 MgSO47H2O KCl 酵母膏 水解 酪素 5g 1g 1.2g 0.9g 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 注：上述兩種培養(yǎng)基中的物質(zhì)溶解后，均用蒸餾水定容至1000mL。 ①從功能上來看，上述兩種培養(yǎng)基均屬于____________培養(yǎng)基。 ②如果要對土壤中分解尿素的細菌進行分離，則需要選擇____________(填“A”或“B”)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中的碳源是______________________。 ③在分離尿素分解菌所用的培養(yǎng)基中可加入__________指示劑，根據(jù)指示劑的顏色可鑒定某種細菌能否分解尿素，若有分解尿素的細菌，培養(yǎng)基將會呈現(xiàn)__________。 (2)下圖是某同學采用的接種微生物的方法，請回答下列問題： ①本實驗采用的接種微生物的方法是_______________法，把聚集的菌種逐步______________分散到培養(yǎng)基的表面，為達到這一目的，操作上應注意：_________________________________ ___________________________________________________________________(至少答2項)。 ②三位同學用涂布平板法測定同一土壤樣品中細菌數(shù)量，在對應稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下統(tǒng)計結果： 甲同學涂布了兩個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是236和260，取平均值248； 乙同學涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是210、240和250，取平均值233； 丙同學涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是21、212和256，取平均值163； 在三位同學的統(tǒng)計中，____________同學的統(tǒng)計結果是正確的。 答案　(1)①選擇?、贏　葡萄糖　③酚紅　紅色 (2)①平板劃線　稀釋　每次劃線前要灼燒接種環(huán)；冷卻后從上一次劃線的末端開始劃線?、谝? 解析　(1)①據(jù)題表中的培養(yǎng)基的配方分析可知，A組培養(yǎng)基中的氮源為尿素，是篩選尿素分解菌的選擇培養(yǎng)基。B組培養(yǎng)基中的碳源是纖維素，是篩選纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基。 ②對土壤中分解尿素的細菌進行分離時，需要使用以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，故應當選擇A組培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中的碳源是葡萄糖。③尿素分解菌可以用酚紅指示劑進行鑒定。尿素分解菌產(chǎn)生的脲酶能夠將尿素分解為氨而使培養(yǎng)基pH升高，使酚紅指示劑呈紅色。 (2)①據(jù)圖分析可知，圖示表示平板劃線法接種，是把聚集的菌種逐步稀釋到培養(yǎng)基的表面，操作上應注意每次劃線前要灼燒接種環(huán)；冷卻后從上一次劃線的末端開始劃線。②在進行平板菌落計數(shù)時，應選擇菌落數(shù)在30～300之間的平板，同時為減小誤差應選擇至少3個或3個以上的平板進行計數(shù)并取平均值，在三位同學的統(tǒng)計中，乙同學的統(tǒng)計結果是正確的。 7．大腸桿菌是與我們?nèi)粘Ｉ盥?lián)系非常密切的細菌，請回答有關檢測飲用水中大腸桿菌的問題： (1)檢測飲用水中大腸桿菌的含量時，通常將樣品進行一系列的梯度稀釋，將不同稀釋度的水樣用涂布器分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進行培養(yǎng)，然后記錄菌落數(shù)，這種方法稱為____________________。 判斷下面所示的4個菌落分布圖中，不可能是用該方法得到的是______________。 (2)用上述方法統(tǒng)計樣本中菌落數(shù)時是否需要設置對照組？____________________(填“需要”或“不需要”)，其原因是需要判斷培養(yǎng)基____________________，對于固體培養(yǎng)基應采用的檢測方法是將____________________的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置一段時間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生。 (3)在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿進行_____________(填“消毒”或“滅菌”)處理；操作者的雙手需要進行清洗和____________；靜止空氣中的細菌可用紫外線殺滅，其原因是紫外線能使其內(nèi)蛋白質(zhì)變性，還能損傷它的____________結構。 (4)檢測大腸桿菌實驗結束后，使用過的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經(jīng)過________________處理才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴散。 答案　(1)涂布平板法　D　(2)需要　是否被雜菌污染(或滅菌是否合格)　未接種　(3)滅菌　消毒　DNA　(4)滅菌 解析　D中菌落分布情況為平板劃線法所得。為判斷培養(yǎng)基是否被雜菌污染(或滅菌是否合格)，本實驗需要設置對照組?？蓪⑽唇臃N的培養(yǎng)基在適宜的溫度條件下放置一段時間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生，若發(fā)現(xiàn)有菌落產(chǎn)生說明培養(yǎng)基已被污染。消毒是指使用較為溫和的物理或化學方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)；滅菌是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。對培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿要進行滅菌處理，操作者的雙手需要進行清洗和用酒精消毒。 8．某化工廠的污水池中含有一種有害的難以降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如下圖所示。請分析回答下列問題： (1)培養(yǎng)基中加入化合物A的目的是________________________________________________， 這種培養(yǎng)基屬于______________培養(yǎng)基。 (2)“目的菌”生長所需的氮源和碳源是來自培養(yǎng)基中的______________。實驗需要振蕩培養(yǎng)，由此推測“目的菌”的代謝類型是______________。 (3)在上述實驗操作過程中，獲得純凈“目的菌”的關鍵是_____________________________。 (4)轉為固體培養(yǎng)基時，常采用平板劃線的方法進行接種，此過程中所用的接種工具是______________，操作時采用______________滅菌的方法。 答案　(1)篩選目的菌　選擇　(2)化合物A　異養(yǎng)需氧型　(3)防止外來雜菌入侵　(4)接種環(huán)　灼燒 解析　(1)在選擇培養(yǎng)基中加入特定物質(zhì)，可以篩選出特定的細菌。(2)根據(jù)題目所給的培養(yǎng)基配方，“目的菌”生長所需的氮源和碳源只能來自培養(yǎng)基中的化合物A。異養(yǎng)需氧型細菌在培養(yǎng)時需要振蕩。(3)獲得純凈“目的菌”的關鍵是防止外來雜菌入侵。(4)用平板劃線的方法進行接種時，所使用的接種工具是接種環(huán)，操作時一般采用灼燒滅菌的方法。 9．現(xiàn)在國家大力提倡無紙化辦公，但是每年仍然不可避免地產(chǎn)生大量廢紙，其主要成分是木質(zhì)纖維，人類正努力將其轉化為一種新的資源——乙醇。下圖是工業(yè)上利用微生物分解纖維素生產(chǎn)乙醇的基本工藝流程。請回答相關問題： (1)將從土壤中獲得的微生物培養(yǎng)在以________為唯一碳源的培養(yǎng)基上。純化菌種時，為了得到單一菌落，常采用的接種方法有兩種，即__________和_______________________________。 (2)在含纖維素的培養(yǎng)基中通常加入__________染液，此染液可與纖維素形成________色復合物。用含有此染料的該種培養(yǎng)基培養(yǎng)纖維素分解菌時，培養(yǎng)基上會出現(xiàn)以該菌的菌落為中心的________。我們可以通過此方法來篩選纖維素分解菌。 答案　(1)纖維素　平板劃線法　涂布平板法　(2)剛果紅　紅　透明圈 解析　(1)要從土壤中獲得能分解纖維素的微生物，需要將土壤中獲得的微生物培養(yǎng)在以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基上。純化菌種時，常用的接種方法有平板劃線法和涂布平板法。(2)在培養(yǎng)基中加入剛果紅染液，可與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復合物，當纖維素被分解后，紅色復合物不能形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，從而可篩選纖維素分解菌。 10．(2015全國Ⅰ，39)已知微生物A可以產(chǎn)生油脂，微生物B可以產(chǎn)生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生產(chǎn)?；卮鹩嘘P問題： (1)顯微觀察時，微生物A菌體中的油脂通?？捎胈_____________染色。微生物A產(chǎn)生的油脂不易揮發(fā)，可選用________(填“萃取法”或“水蒸氣蒸餾法”)從菌體中提取。 (2)為了從自然界中獲得能產(chǎn)生脂肪酶的微生物B的單菌落，可從含有油料作物種子腐爛物的土壤中取樣，并應選用以________為碳源的固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。 (3)若要測定培養(yǎng)液中微生物B的菌體數(shù)，可在顯微鏡下用____________________直接計數(shù)；若要測定其活菌數(shù)量，可選用____________________法進行計數(shù)。 (4)為了確定微生物B產(chǎn)生的脂肪酶的最適溫度，某同學測得相同時間內(nèi)，在35℃、40℃、45℃溫度下降解10g油脂所需酶量依次為4mg、1mg、6mg，則上述三個溫度中，________℃條件下該酶活力最小。為了進一步確定