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基因工程 精選大題 例：（2018全國卷II)某種熒光蛋白（GFP）在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白（L1）基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1-GFP融合基因（簡稱為甲），并將其插入質粒P0，構建了真核表達載體P1，其部分結構和酶切位點的示意圖如下，圖中E1~E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同。 回答下列問題： （1）據(jù)圖推斷，該團隊在將甲插入質粒P0時，使用了兩種限制酶，這兩種酶是_________。使用這兩種酶進行酶切是為了保證_______________，也是為了保證__________________。 （2）將P1轉入體外培養(yǎng)的牛皮膚細胞后，若在該細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了________和_________過程。 （3）為了獲得含有甲的牛，該團隊需要做的工作包括：將能夠產(chǎn)生綠色熒光細胞的_____________移入牛的____________中、體外培養(yǎng)、胚胎移植等。 （4）為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR方法進行鑒定。在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的____________（填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”）作為PCR模板。 【答案】（1）E1和E4 甲的完整甲與載體正確連接 （2）轉錄翻譯 （3）細胞核去核卵母細胞 （4）核DNA 【解析】（1）要保證目的基因在受體細胞中能夠正確表達，目的基因的首端應有啟動子，尾端應有終止子。甲是將某種病毒的外殼蛋白（L1）基因連接在GFP基因的5ˊ末端而獲得的L1-GFP融合基因，據(jù)此結合題意并分析圖示可知：該團隊在將甲插入質粒P0時，如果用E2或E3，則目的基因不完整，而使用E1和E4這兩種限制酶進行酶切保證了甲的完整，而且也保證了甲與載體正確連接，因此，使用的兩種限制酶，是E1和E4。（2）構建的真核表達載體P1中含有GFP基因，而GFP基因的表達產(chǎn)物“某種熒光蛋白（GFP）”在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光。若在導入P1的牛皮膚細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了表達。基因的表達過程包括轉錄和翻譯。（3）若要獲得含有甲的牛，可采用核移植技術，即將能夠產(chǎn)生綠色熒光細胞的細胞核移入牛的去核卵母細胞中獲得重組細胞，并將該重組細胞在體外培養(yǎng)成重組胚胎，再經(jīng)過胚胎移植等獲得含有甲的牛。（4）PCR是多聚酶鏈式反應的縮寫，是一種在生物體外復制特定DNA片斷的核酸合成技術。若利用PCR方法檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，則應分別以該牛不同組織細胞中的核DNA作為PCR模板。 模擬精做 1．（2018屆黑龍江省普通高等學校招生全國統(tǒng)一考試仿真模擬（十)）馬鈴薯含有豐富的淀粉、氨基酸、多種維生素和無機鹽，是種植廣泛的農(nóng)作物。侵染病毒后導致產(chǎn)量大幅下降，培育脫毒和抗毒的馬鈴薯品種是提高產(chǎn)量的有效方法。請回答下列問題： （1）利用馬鈴薯的莖尖進行離體培養(yǎng)可以獲得脫毒苗，原因在于____________________，該過程依據(jù)的原理是_________________________________。 （2）為獲得抗病毒的馬鈴薯植株，往往采用轉基因技術，將病毒復制酶基因轉移到馬鈴薯體內(nèi)。其過程大致如圖所示： ①構建基因表達載體過程中需要用__________（酶）處理。目的基因轉錄過程中，__________能使轉錄在所需要的地方停止下來。 ②將目的基因導入馬鈴薯細胞使用了__________法，要用__________處理土壤農(nóng)桿菌，使之轉變?yōu)楦惺軕B(tài)，然后將它們在緩沖液中混合培養(yǎng)以完成轉化過程。 ③目的基因導入馬鈴薯細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達，要通過檢測與鑒定，馬鈴薯的DNA上是否插入了目的基因的檢測方法是____________________。 （3）生產(chǎn)上常將上述轉基因作物與非轉基因作物混合播種，其目的是降低病毒的__________基因頻率的增長速率。 【答案】（1）莖尖病毒極少甚至無病毒（植物）細胞具有全能性 （2）①限制酶（或限制性核酸內(nèi)切酶）和DNA連接酶終止子②農(nóng)桿菌轉化Ca2+③DNA分子雜交技術 （3）抗性 【解析】（1）馬鈴薯莖尖病毒極少甚至無病毒，可以用來培養(yǎng)脫毒苗，植物組織培養(yǎng)依據(jù)的原理是植物細胞的全能性。（2）①構建基因表達載體，需要的工具酶有限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，基因表達載體中的終止子使轉錄在所需要的地方停止下來。②將外源基因導入植物體內(nèi)用農(nóng)桿菌轉化法，用Ca2+處理土壤農(nóng)桿菌，使之轉變?yōu)楦惺軕B(tài)，使外源基因容易導入。③DNA上是否插入了目的基因的檢測方法是DNA分子雜交技術。（3）轉基因作物與非轉基因作物混合播種，可降低抗性作物對害蟲的選擇性，使害蟲種群中的抗性基因頻率增長率減慢。 2．（2019屆河南省洛陽市高三上學期尖子生第一次聯(lián)考）科研人員利用胚胎干細胞(ES細胞)對干擾素基因缺失小鼠進行基因治療，其技術流程如下圖。請回答相關問題： (1)過程①獲得重組胚胎之前，需要通過____________技術獲得重組細胞。 (2)將基因導入ES細胞而不是導入到上皮細胞，是因為__________________。 (3)步驟③中，需要構建含有干擾素基因的__________。由于DNA復制時，子鏈只能由5′向 3′方向延伸，故構建前利用PCR技術擴增干擾素基因時，可以從圖2中A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取_______________作為引物。對干擾素基因片段和質粒進行酶切時，可選用限制酶的組合為________________或_______________。 (4)將步驟③獲得的ES細胞在熒光顯微鏡下觀察，選擇發(fā)___________色熒光的細胞進行體外誘導。為檢測干擾素基因是否表達，可以采用_____________的方法。 【答案】（1）核移植 （2）ES細胞具有發(fā)育的全能性 （3）基因表達載體B和CHindⅢ和PstⅠEcoRⅠ和PstⅠ （4）綠抗原-抗體雜交 【解析】 (1) 圖1是利用胚胎干細胞（ES 細胞）對干擾素基因缺失小鼠進行基因治療的流程，其中過程①采用了動物細胞核移植技術。(2) 圖1中的ES細胞是取自于囊胚期的內(nèi)細胞團。ES細胞在功能上具有發(fā)育的全能性，體外誘導ES細胞可以使其向不同方向分化，所以將目的基因導入ES細胞而不是上皮細胞。(3) 步驟③是將干擾素基因（目的基因）導入ES細胞中，在導入之前需要構建含有干擾素基因的基因表達載體。因DNA復制時，子鏈總是從5′向 3′方向延伸，子鏈與模板鏈反向平行，所以利用PCR技術擴增干擾素基因時，可以從圖2的A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取B和C片段作為引物。由圖2可以看出，用限制酶SmaⅠ切割會破壞干擾素基因，為將完整的干擾素基因切割下來，需要利用限制酶組合HindⅢ和 PstⅠ或 EcoRⅠ和 PstⅠ切割干擾素基因的兩端，這樣也可以使如圖3所示質粒上保留一個完整的標記基因，即綠色熒光蛋白基因。(4) 綜上分析，在構建的重組質粒上，紅色熒光蛋白基因的結構已經(jīng)被破壞，但綠色熒光蛋白基因的結構完整，因此將步驟③獲得的 ES 細胞在熒光顯微鏡下觀察，應選擇只發(fā)綠色熒光的細胞進行體外誘導。為檢測干擾素基因是否表達，需采用抗原-抗體雜交技術，若有雜交帶出現(xiàn)，表明干擾素基因已經(jīng)成功表達。 3．（2019屆河南省示范性高中高三上學期期終考試）馬鈴薯是全球第四大重要的糧食作物，僅次于小麥、水稻和玉米。近年來對馬鈴薯育種的研究越來越多。請回答下列問題 (1)馬鈴薯在無性繁殖過程中感染的病毒易傳播給后代，從而影響后代的產(chǎn)量和品質，可采用___________技術來脫除病毒，原因是_________________________________。 (2)科學家常采用___________法將控制HPV-16病毒(人宮頸癌病毒)外殼蛋白合成的基因導入馬鈴薯細胞，培育出可生產(chǎn)的且抗該病毒的轉基因馬鈴薯，人食用后可獲得抗性。若要使目的基因在受體細胞中表達，需要構建基因表達載體而不能直接將目的基因導入受體細胞，原因是______________________、______________________。實驗發(fā)現(xiàn)，該轉基因馬鈴薯經(jīng)烹煮后抗病毒效果較差，分析其原因可能是 。 (3)轉基因食品的安全性備受關注，若要確定某食品是不是轉基因生物或是通過轉基因技術加工而成的，可以從______________________、______________________等方面進行檢測。 【答案】（1）莖尖組織培養(yǎng)植物分生區(qū)附近如莖尖的病毒極少，甚至無病毒 （2）農(nóng)桿菌轉化目的基因無復制原點目的基因無表達所需的啟動子烹煮時，高溫破壞了病毒外殼蛋白的空間結構，使其抗病毒的功能喪失 （3）檢測其是否含有外源基因或DNA 檢測其是否含有外源基因表達的蛋白質 【解析】（1）根據(jù)分析可知，馬鈴薯莖尖病毒極少甚至無病毒，因此可將馬鈴薯莖尖接種在培養(yǎng)基中，經(jīng)過組織培養(yǎng)獲得脫毒苗。（2）馬鈴薯為雙子葉植物，將目的基因導入雙子葉植物細胞常用的方法為農(nóng)桿菌轉化法。啟動子位于基因的首端，它是RNA聚合酶結合和識別的部位，有了它才能啟動基因轉錄，由于目的基因無復制原點、無表達所需的啟動子，故需要將目的基因與運載體結合構建形成基因表達載體，然后再導入受體細胞。由于目的基因表達的產(chǎn)物是病毒外殼蛋白，烹煮時，高溫破壞了病毒外殼蛋白的空間結構，使其抗病毒的功能喪失，故該轉基因馬鈴薯經(jīng)烹煮后抗病毒效果較差。（3）基因工程是將外源基因導入受體細胞并在細胞內(nèi)表達的過程。若要確定某食品是不是轉基因生物或是通過轉基因技術加工而成的，可以檢測其是否含有外源基因或DNA以及檢測其是否含有外源基因表達的蛋白質等方面進行檢測。 4．（2019屆安徽省蕪湖市高三上學期期末考試）國際水稻研究所人員從產(chǎn)量低的耐淹水稻中找到一種耐淹基因，將其移入到高產(chǎn)熱帶水稻中，終于培育出耐淹的高產(chǎn)水稻品系，其產(chǎn)量比高產(chǎn)熱帶水稻產(chǎn)量還要高。耐淹基因移入的方法可通過轉基因技術實現(xiàn)。請回答下列相關問題： （1）為培育耐淹的高產(chǎn)水稻品系，應需將耐淹基因進行體外擴增。在PCR反應體系中加入了熱穩(wěn)定DNA聚合酶、引物等，還加入耐淹基因作為___________，加入___________作為合成DNA的原料。 （2）質粒常被用作運載體，因為質粒具有___________（答2點即可）。構建耐淹基因的質粒表達載體時，常用不同的限制酶對耐淹基因和質粒進行切割，目的是___________。 （3）根據(jù)耐淹基因表達的蛋白質，研究人員通過對它的氨基酸序列設計并人工合成耐淹基因。與水稻的耐淹基因相比，人工合成的耐淹基因在結構上缺少了___________。雖然兩種基因轉錄的產(chǎn)物不同，但最終表達出相同的蛋白質，可能原因是___________。 （4）蛋白質工程中，要對蛋白質結構進行設計改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不直接改造蛋白質的原因是___________。 【答案】（1）模板 dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) （2）能在宿主細胞內(nèi)復制并穩(wěn)定存在；具有多個限制酶切位點，方便剪切；具有標記基因，便于檢測和篩選減少耐淹基因及質粒的自身環(huán)化、增大耐淹基因正向（正確）連接的概率 （3）啟動子、終止子和內(nèi)含子密碼子具有簡并性 （4）改造基因易于操作且改造后能夠遺傳 【解析】 (1)利用PCR技術在體外擴增耐淹基因（目的基因）時，在PCR反應體系中除了加入熱穩(wěn)定DNA聚合酶、引物等外，還加入耐淹基因作為模板，加入dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) 作為合成DNA的原料。(2) 質粒被用作運載體，應具備的條件有：能在宿主細胞內(nèi)復制并穩(wěn)定存在；具有多個限制酶切位點，方便剪切；具有標記基因，便于檢測和篩選。構建耐淹基因的質粒表達載體時，用不同的限制酶對耐淹基因和質粒進行切割，可以減少耐淹基因及質粒的自身環(huán)化、使耐淹基因定向連接到質粒上，以增大耐淹基因正向（正確）連接的概率。(3) 與水稻的耐淹基因相比，根據(jù)耐淹基因表達的蛋白質的氨基酸序列推測出的mRNA分子中，缺乏與基因中的啟動子、終止子和內(nèi)含子相對應的堿基序列，據(jù)此設計并人工合成的耐淹基因在結構上缺少了啟動子、終止子和內(nèi)含子。由于密碼子具有簡并性，雖然兩種基因轉錄的產(chǎn)物不同，但最終能夠表達出相同的蛋白質。(4)由于直接改造的蛋白質不能遺傳，而改造基因易于操作且改造后能夠遺傳，所以在蛋白質工程中，要對蛋白質結構進行設計改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不直接改造蛋白質。