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專題十六　基因工程和細胞工程 1．(2018深圳調(diào)研)葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源基因整合到葉綠體基因組中，該技術(shù)能有效改良植物的品質(zhì)。請回答： (1)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的核心步驟是__基因表達載體的構(gòu)建__，完成該步驟所需要的酶有__限制酶和DNA連接酶__。 (2)將植物體細胞處理得到原生質(zhì)體，再通過__農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法__或__基因槍__法，將目的基因?qū)朐|(zhì)體，使原生質(zhì)體再生出細胞壁之后，通過__植物組織培養(yǎng)__技術(shù)培養(yǎng)可得到相應的轉(zhuǎn)基因幼苗。 (3)來自原核生物中有重要價值的外源基因，無需改造和修飾就可在葉綠體中高效表達，就此分析，原因是__葉綠體DNA與原核生物DNA結(jié)構(gòu)類似(由于葉綠體大多數(shù)基因的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄與翻譯系統(tǒng)均與原核生物類似)__。 (4)對大多數(shù)高等植物而言，與傳統(tǒng)的細胞核轉(zhuǎn)基因相比，葉綠體轉(zhuǎn)基因更穩(wěn)定，其遺傳方式__不遵循__(答“遵循”或“不遵循”)分離定律，不會隨__花粉__(“花粉”或“卵細胞”)傳給后代，從而保持了__母本__(“父本”或“母本”)的遺傳特性。 [解析]　(1)基因工程的核心步驟是基因表達載體的構(gòu)建，所需要的酶有限制酶和DNA連接酶；(2)植物細胞導入受體細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法。原生質(zhì)體再生細胞壁之后，通過植物組織培養(yǎng)獲取幼苗；(3)葉綠體DNA與原核生物DNA結(jié)構(gòu)類似。(4)分離定律適用于有性生殖過程中細胞核遺傳，故葉綠體轉(zhuǎn)基因不遵循分離定律，為母系遺傳。 2．(2018天津市和平區(qū)生物一模)已知某傳染性疾病的病原體為RNA病毒，該病毒表面的A蛋白為主要抗原。疫苗的生產(chǎn)和抗體的制備流程如圖1所示。請回答下列問題： (1)過程①代表的是__逆轉(zhuǎn)錄__，過程③構(gòu)建A基因重組載體時，啟動子和終止子是重新構(gòu)建的，它們應該能被受體細胞的__RNA聚合酶__所識別，以便于其催化轉(zhuǎn)錄過程。 (2)如圖2為A基因的結(jié)構(gòu)示意圖，已知Ⅱ區(qū)的堿基數(shù)是2000個，其中陰影區(qū)域堿基數(shù)是800個，空白區(qū)域中G和C的總數(shù)共有400個，則由該區(qū)域能指導蛋白質(zhì)合成的片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA中A和U總數(shù)是__400__個。 (3)在給小鼠皮下注射A蛋白時，要重復注射幾次的目的是通過二次免疫，增加小鼠體內(nèi)的__漿細胞__數(shù)目。 (4)在將X進行擴大培養(yǎng)前，至少需要經(jīng)過2次篩選，第一次是將__雜交瘤細胞__篩選出來，第二次是將__能分泌所需抗體的雜交瘤細胞__篩選出來。 (5)對健康人進行該傳染病免疫預防時，可選用圖中基因工程生產(chǎn)的__A蛋白__來制備疫苗。對該傳染病疑似患者確診時，可以從疑似患者體內(nèi)分離出病毒與已知病毒進行核酸序列比較，或用圖中的__抗A蛋白的單克隆抗體__與分離出的病毒進行特異性檢測。 [解析]　(1)由以上分析可知①是逆轉(zhuǎn)錄。啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點，能啟動轉(zhuǎn)錄過程。(2)已知圖中Ⅱ區(qū)的堿基數(shù)是2000個，其中陰影區(qū)域堿基數(shù)是800個，則空白區(qū)域中堿基總數(shù)為1200個，又已知空白區(qū)域中G和C的總數(shù)為400個，則A＋T總數(shù)為800個，每條鏈中A＋T總數(shù)為400個，根據(jù)堿基互補配對原則，由該區(qū)轉(zhuǎn)錄形成的成熟mRNA中A和U總數(shù)也是400個。(3)在給小鼠皮下注射A蛋白時，要重復注射幾次的目的是通過二次免疫，增加小鼠體內(nèi)的漿細胞數(shù)目。(4)在將X進行擴大培養(yǎng)前，至少需要經(jīng)過2次篩選，第一次是用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞，第二次是采用抗體陽性檢測法篩選出能夠產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細胞。(5)對健康人進行該傳染病免疫預防時，可選用圖中基因工程生產(chǎn)的A蛋白所制備的疫苗。對該傳染病疑似患者確診時，可以從疑似患者體內(nèi)分離出病毒，與已知病毒進行核酸序列比較；或采用抗原—抗體雜交法，即用圖中的抗A蛋白的單克隆抗體進行特異性結(jié)合檢測。 3．如圖為三種質(zhì)粒和一個含目的基因的DNA片段，其中ApR為氨芐青霉素抗性基因，TcR為四環(huán)素抗性基因，lacZ為藍色顯色基因，EcoR Ⅰ(0.7 kb)、Pvu Ⅰ(0.8 kb)等為限制酶和其切割位點及其與復制原點之間的距離。已知1 kb＝1 000個堿基對，請回答下列問題： (1)片段D為目的基因中的某一片段，則DNA聚合酶和DNA連接酶的作用形成的鍵依次是__②__(填圖中數(shù)字)。 (2)圖中作為目的基因運載體最理想的質(zhì)粒是__B__(填“A”“B”或“C”)，請據(jù)圖分析，其他兩種質(zhì)粒一般不能作為運載體的理由分別是__質(zhì)粒A不含有標記基因；質(zhì)粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時，復制原點會被破壞，使該質(zhì)粒無法進行復制__。 (3)用EcoR Ⅰ全酶切目的基因和質(zhì)粒B形成的重組質(zhì)粒，并進行電泳觀察，可出現(xiàn)長度分別為1．1 kb和__5.6__kb的兩個片段，或者長度分別為__3.6_kb和3.1_kb__的兩個片段(重組質(zhì)粒上目的基因的插入位點與EcoRⅠ的識別位點之間的堿基對忽略不計)。 (4)將分別用限制酶PvuⅠ切開的質(zhì)粒B溶液與目的基因溶液混合，加入DNA連接酶后，進行大腸桿菌受體細胞導入操作，則受體細胞的類型包含__ABD__(多選)。 A．ApR藍色　　 B．ApR白色 C．ApS、藍色　　 D．ApS白色 (5)動物基因工程通常以受精卵作為受體細胞的根本原因是__B__。 A．受精卵能使目的基因高效表達 B．受精卵可發(fā)育成動物個體 C．受精卵更易接受DNA的插入 D．受精卵體積較大，便于DNA導入操作 [解析]　(1)DNA聚合酶和DNA連接酶的作用形成的鍵均為磷酸二酯鍵，因此都應為②。(2)由題圖可知，切割目的基因應用PvuⅠ，但該限制酶會將c質(zhì)粒的復制原點破壞，使該質(zhì)粒無法進行復制，而質(zhì)粒A不含有標記基因，因此兩者都不能作為運載體。(3)根據(jù)題意，質(zhì)粒B長度為2.7 kb，目的基因長度為4.0 kb，所以重組質(zhì)粒長度為6.7 kb，如果出現(xiàn)長度為1．1 kb的一個片段，則另外一個片段的長度為5.6 kb。若目的基因與運載體反向連接，可形成長度分別為3.1 kb和3.6 kb的兩個片段。(4)將分別用限制酶PvuⅠ切開的質(zhì)粒B溶液與目的基因溶液混合，加入DNA連接酶后，可得到質(zhì)粒自身環(huán)化形成的普通質(zhì)粒、重組質(zhì)粒和目的基因自身連接的DNA環(huán)三種類型。如果導入的是普通質(zhì)粒，受體細胞的類型為A(ApR、藍色)，如果導入的是重組質(zhì)粒，受體細胞的類型為B(ApR、白色)，如果導入的是DNA環(huán)，受體細胞的類型為D(ApS、白色)。(5)動物基因工程通常選用受精卵作為受體細胞的根本原因是受精卵可發(fā)育成動物個體。 4．人乳頭狀瘤病毒(HPV)與宮頸癌的發(fā)生密切相關，抗HPV的單克隆抗體可以準確檢測出HPV，從而及時監(jiān)控宮頸癌的發(fā)生，以下是以HPV衣殼蛋白為抗原制備出單克隆抗體的過程，請據(jù)圖回答下列問題： (1)單克隆抗體制備過程中涉及的細胞工程技術(shù)有__動物細胞培養(yǎng)、動物細胞融合__。 (2)若要分析雜交瘤細胞中染色體，可通過__解離、漂洗、染色和制片__等過程制成裝片，然后在顯微鏡下觀察。雜交瘤細胞中染色體數(shù)目與普通淋巴細胞相比具有的特點是__染色體數(shù)目加倍__，在HAT培養(yǎng)基上存活的細胞可能包括__①②③__(填下列序號)。 ①無抗體分泌的細胞 ②抗HPV抗體的分泌細胞 ③其他無關抗體的分泌細胞 (3)對于抗體檢測呈__陽__性的雜交瘤細胞應盡早進行克隆化，克隆化的方法最常用的是有限稀釋法，即稀釋細胞到3～10個/ mL，每孔加入細胞稀釋液__0.1__mL，使每個孔內(nèi)不多于一個細胞，達到單克隆培養(yǎng)的目的。 (4)由上述過程生產(chǎn)出的單克隆抗體不能直接用于人體，理由是__小鼠形成的抗體對人體來說是抗原，存在著排異反應__。 (5)科學家從某些無限增殖細胞的細胞質(zhì)中分離出了無限增殖調(diào)控基因(prG)，該基因能激發(fā)動物細胞分裂，這為單克隆抗體的制備提供了更多的思路。除本題描述的制備單克隆抗體技術(shù)外，請再簡要寫出一種制備單克隆抗體的思路。 __通過基因工程向漿細胞中導入prG；利用核移植技術(shù)將漿細胞的細胞核移植到去核的無限增殖細胞中(答對其一即可)__。 [解析]　(2)利用顯微鏡觀察有絲分裂過程中的染色體，需先制作臨時裝片；雜交瘤細胞中含有漿細胞和骨髓瘤細胞的染色體，所以比普通淋巴細胞的染色體數(shù)目多一倍；在HAT培養(yǎng)基上生存的細胞均為雜交細胞，這些雜交細胞中有分泌HPV抗體的細胞，有分泌其他抗體的細胞，也有不能分泌抗體的細胞。(3)抗體檢驗呈陽性，說明該雜交瘤細胞可產(chǎn)生所需抗體；為保證每個小孔不多于一個細胞，根據(jù)濃度可推斷加入細胞稀釋液的量：設加入細胞稀釋液的最大量是X，則10個/ mLX＝1個，X＝0.1 mL。(4)小鼠形成的抗體與人體抗體不同，故在人體內(nèi)可引起免疫反應，所以上述過程生產(chǎn)出的單克隆抗體不能直接用于人體。(5)根據(jù)所給信息可知，還可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或核移植技術(shù)獲得既能大量增殖，又能產(chǎn)生特定抗體的雜交細胞。 5．(2017陜西西安長安一中第一次檢測)下圖是植物體細胞雜交過程示意圖，請據(jù)圖回答： (1)植物體細胞雜交的第①步是去掉細胞壁，分離出有活力的原生質(zhì)體。目前此步驟最常用的方法是酶解法，也就是在溫和的條件下用__纖維素酶、果膠酶__等分解植物的細胞壁。 (2)②過程的發(fā)生，必須進行人工誘導。人工誘導原生質(zhì)體融合常用的化學方法是用__聚乙二醇__試劑作為誘導劑誘導融合。動物細胞融合還常用到__滅活的病毒__作為誘導劑。 (3)與過程③密切相關的具有單層膜結(jié)構(gòu)的細胞器為__高爾基體__。 (4)④過程稱為__脫分化__，⑤過程稱為__再分化__。若利用此技術(shù)生產(chǎn)治療癌癥的藥物——紫杉醇，培養(yǎng)將進行到__e__(填字母編號)即可。 (5)植物體細胞雜交在育種工作中具有廣泛的應用價值，其突出的優(yōu)點是可以__克服遠緣雜交不親和的障礙__。 [解析]　(1)植物體細胞雜交的第①步是用纖維素酶和果膠酶去掉細胞壁，分離出有活力的原生質(zhì)體。(2)人工誘導原生質(zhì)體融合常用的化學方法是用聚乙二醇試劑作為誘導劑誘導融合。動物細胞融合還常用到滅活的病毒作為誘導劑。(3)過程⑧是雜種細胞生出細胞壁，高爾基體與植物細胞壁形成有關。(4)④⑤過程分別為脫分化和再分化，治療癌癥的藥物——紫杉醇是從紫杉細胞中提取的，只需將植物組織培養(yǎng)進行到愈傷組織階段即可。(5)植物體細胞雜交在育種工作中具有廣泛的應用價值，其突出的優(yōu)點是可以克服遠緣雜交不親和障礙，大大擴展可用于雜交的親本組合范圍。 6．(2018全國卷Ⅱ)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1－GFP融合基因(簡稱為甲)，并將其插入質(zhì)粒P0，構(gòu)建了真核表達載體P1，其部分結(jié)構(gòu)和酶切位點的示意圖如下，圖中E1～E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同。 回答下列問題： (1)據(jù)圖推斷，該團隊在將甲插入質(zhì)粒P0時，使用了兩種限制酶，這兩種酶是__E1和E4__。使用這兩種酶進行酶切是為了保證__甲的完整__，也是為了保證__甲與載體正確連接__。 (2)將P1轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛皮膚細胞后，若在該細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了__轉(zhuǎn)錄__和__翻譯__過程。 (3)為了獲得含有甲的牛，該團隊需要做的工作包括：將能夠產(chǎn)生綠色熒光細胞的__細胞核__移入牛的__去核卵母細胞__中、體外培養(yǎng)、胚胎移植等。 (4)為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR方法進行鑒定，在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的__核DNA__(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作為PCR模板。 [解析]　(1)由題意可知，L1基因和GFP基因合成了L1－GFP融合基因(簡稱為甲)，題圖中顯示了四個酶切位點，當將L1－GFP融合基因插入質(zhì)粒P0時，可用E1和E4限制酶進行酶切，用這兩種酶進行酶切不會破壞甲的完整性，同時能保證甲按照正確的方向與載體連接。 (2)若在牛皮膚細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1－GFP融合基因得到表達，即目的基因在受體細胞中通過轉(zhuǎn)錄和翻譯合成了熒光蛋白。 (3)為了獲得含有甲的牛，可將含有目的基因的細胞的細胞核移入牛的去核卵母細胞中，然后進行體外培養(yǎng)、胚胎移植等。 (4)利用PCR技術(shù)擴增目的基因，可以檢測目的基因是否存在。PCR擴增的模板是DNA。 7．(2018天津卷)甲型流感病毒為RNA病毒，易引起流感大規(guī)模流行。我國科學家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環(huán)節(jié)如下。 (1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成對應DNA后，利用__PCR__技術(shù)擴增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達時不能合成完整長度的__多肽(或蛋白質(zhì))__，因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原等其他基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒，并保存。 (2)構(gòu)建適合改造病毒增殖的轉(zhuǎn)基因宿主細胞。設計合成一種特殊tRNA的基因，其產(chǎn)物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結(jié)合，并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與__載體__連接后導入宿主細胞。提取宿主細胞的__總RNA__進行分子雜交鑒定，篩選獲得成功表達上述tRNA的轉(zhuǎn)基因宿主細胞。 (3)利用轉(zhuǎn)基因宿主細胞制備疫苗。將(1)中的重組質(zhì)粒導入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細胞，并在補加__非天然氨基酸(Uaa)__的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，則該宿主細胞能利用上述特殊tRNA，翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，產(chǎn)生大量子代病毒，用于制備疫苗。 特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄時，識別其啟動子的酶是__D__(單選)。 A．病毒的DNA聚合酶　　 B．宿主的DNA聚合酶 C．病毒的RNA聚合酶　　 D．宿主的RNA聚合酶 (4)上述子代病毒不能在正常宿主細胞中增殖，沒有致病性，因此不經(jīng)滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比，該病毒活疫苗的優(yōu)勢之一是可引起__細胞__免疫，增強免疫保護效果。 [解析]　(1)體外進行DNA擴增采用的技術(shù)手段是聚合酶鏈式反應(PCR技術(shù))。將基因內(nèi)個別編碼氨基酸的序列改造成編碼終止密碼子的序列后，在翻譯時終止密碼子提前出現(xiàn)，不能合成完整長度的多肽(或蛋白質(zhì))。 (2)為了使目的基因能夠在受體細胞中穩(wěn)定存在并正常表達，需要將目的基因與載體(運載體)連接后導入受體細胞。利用分子雜交技術(shù)鑒定，篩選獲得成功表達目的RNA的細胞時，需提取宿主細胞的總RNA。 (3)將(1)中的重組質(zhì)粒導入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細胞，宿主細胞內(nèi)由于沒有Uaa，翻譯將會在終止密碼子處停止，將不能翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻譯出完整蛋白，需要在培養(yǎng)基中加入Uaa。轉(zhuǎn)錄時，識別啟動子的酶為RNA聚合酶，因為轉(zhuǎn)錄在宿主細胞中進行，所以轉(zhuǎn)錄用的酶為宿主細胞的RNA聚合酶。 (4)不具有感染性的滅活病毒不能進入人體細胞內(nèi)，只會引發(fā)體液免疫，而減毒的活疫苗雖然不能在人體細胞內(nèi)正常增殖，但可以侵入人體細胞，能引起人體產(chǎn)生細胞免疫，增強免疫保護效果。 8．(2018江蘇卷)為生產(chǎn)具有特定性能的α－淀粉酶，研究人員從某種海洋細菌中克隆了α－淀粉酶基因(1 656個堿基對)，利用基因工程大量制備α－淀粉酶，實驗流程見下圖。請回答下列問題： (1)利用PCR技術(shù)擴增α－淀粉酶基因前，需先獲得細菌的__基因組DNA__。 (2)為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的__5′__端加上限制性酶切位點，且常在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是__使DNA片段能定向插入表達載體，減少自連__。 (3)進行擴增時，反應的溫度和時間需根據(jù)具體情況進行設定，下列選項中__②__的設定與引物有關，__⑥__的設定與擴增片段的長度有關。(填序號) ①變性溫度　②退火溫度?、垩由鞙囟取、茏冃詴r間?、萃嘶饡r間　⑥延伸時間 (4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α－淀粉酶的mRNA的部分堿基序列： 圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含__8__個密碼子，如虛線框后的序列未知，預測虛線框后的第一個密碼子最多有__13__種。 (5)獲得工程菌表達的α－淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測定酶活性，結(jié)果如下： 緩沖液 50 mmol/L Na2HPO4－KH2PO4 50 mmol/L Tris－HCl 50 mmol/L Gly－NaOH pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5 酶相對活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8 根據(jù)上述實驗結(jié)果，初步判斷該α－淀粉酶活性最高的條件為__pH為8.5，緩沖液為50_mmol/L Tris－HCl__。 [解析]　(1)利用 PCR 技術(shù)擴增α－淀粉酶基因前，需先獲得細菌的基因組DNA作為模板，并依據(jù)α－淀粉酶基因兩端的部分核苷酸序列合成兩條引物。 (2)利用PCR技術(shù)擴增DNA時，只能從3′端延伸DNA子鏈，為了便于擴增的 DNA 片段與表達載體連接，需在引物的5′端加上限制性酶切位點，并且要注意在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點，這樣既能防止目的基因、載體的自身連接，又能確保目的基因與表達載體的定向連接。 (3)PCR技術(shù)包括變性、退火(復性)和延伸三步，變性溫度決定PCR反應中雙鏈DNA的解鏈，且時間很短；退火時引物結(jié)合到互補的DNA單鏈上，退火溫度由引物復性溫度決定，其溫度設定與引物的長度、堿基組成及其濃度等有關；延伸時間與產(chǎn)物片段的長度有關，產(chǎn)物在1 kb以內(nèi)的延伸時間為1 min左右，3～4 kb的延伸時間為3～4 min。 (4)圖中虛線框內(nèi)共含有24個堿基，mRNA上3個相鄰的堿基編碼1個氨基酸，故共包含8個密碼子。虛線框后的第1個密碼子的第1個堿基是U，第2和第3個堿基各有4種可能性，因此共16種可能性。題干表明控制α－淀粉酶的基因有1 656個堿基對，說明圖中虛線框后的第一個密碼子肯定不是終止密碼子(3種終止密碼子為UAA、UAG、UGA)，故虛線框后第一個密碼子實際最多有16－3＝13種可能性。 (5)分析表格中的數(shù)據(jù)，酶相對活性最高為99.5%，對應的條件是pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L Tris－HCl。