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ICS 65.020.01 ICS 65020.30 B43 GB 中華人民共和國國家標準 GB/T XXX-XXX I GB/XX XX—XXXX 芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法 Determination of mangiferin in mango (Mangifera indica L.) leaves – high-performance liquid chromatorgraphy XXX-XX-XX發(fā)布 XXX-XX-XX實施 中華人民共和國標準化管理委員會 發(fā) 布 前??言 本標準按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。 本標準由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院提出。 本標準由中國標準化研究院歸口。 本標準起草單位：中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，中國標準化研究院。 本標準主要起草人：陽辛鳳，蘭韜，席興軍，韓丙軍，趙方方，張月，郭曉杰，王盼 1　 范圍 本標準規(guī)定了用高效液相色譜-質(zhì)譜法測定芒果葉中芒果苷含量的原理、材料、儀器與設備、測定步驟、結果計算與表示、精密度和回收率、檢驗報告。 本標準適用于芒果葉中芒果苷含量的測定。 2　 規(guī)范性引用文件 下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法 GB/T 8855 水果和蔬菜 取樣方法 3　 原理 樣品經(jīng)提取后，將提取液過濾，經(jīng)反向高效液相色譜分離測定，在258nm下檢測，根據(jù)保留時間定性，外標峰面積定量。 4　 試劑與材料 4.1 試劑 4.1.1 甲醇（CH3OH）：色譜純。 4.1.2 乙腈（CH3CN）：色譜純。 4.1.3 甲酸（HCOOH）：色譜純。 4.1.4 甲醇溶液（70%）：甲醇與超純水按照7:3體積比混合。 4.1.5 甲酸溶液（0.1%）：1 L超純水中加入1 mL甲酸。 4.1.6 芒果苷（mangiferin，C19H18O11，CAS : 4773-96-0）對照品：純度≥98%。 4.1.8 流動相：乙腈（4.2）：甲酸溶液（4.5）=15:85（體積比）。 4.1.9 芒果苷標準儲備溶液（200 μg/mL）：稱取10 mg（精確至0.10mg）芒果苷對照品，置于50 mL容量瓶中，加甲醇（4.1）超聲溶解并定容至刻度線，混勻，配制成200 μg/mL的標準儲備溶液，–18℃冰箱避光保存，有效期3個月。 4.1.10 芒果苷中間濃度標準溶液：準確移取0.5mL芒果苷標準儲備溶液于10mL容量瓶中，用甲醇溶液（4.1）稀釋至定容刻度線，搖勻，得到芒果苷中間濃度標準溶液（質(zhì)量濃度10 μg/mL）。–18℃冰箱避光保存，有效期1個月。 4.1.11 芒果苷系列標準工作液：分別準確移取0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL芒果苷中間濃度標準溶液于不同的10mL容量瓶中，用70%甲醇溶液（4.4）稀釋、定容刻度線，搖勻，得到芒果苷系列標準工作溶液（質(zhì)量濃度分別為0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL）。2～8C保存，有效期2周。 4.1.12 除另外有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水應復合GB/T6682中一級水的要求。 4.2.材料 4.2.1 離心管：100 mL（螺旋蓋）。 4.2.2 三角瓶：250 mL（磨口塞）。 4.2.3 容量瓶：10 mL，50 mL，100 mL，250 mL。 4.2.4 刻度玻璃移液管：1m mL 4.2.5針式微孔濾器：孔徑0.22 μm，直徑13 mm的聚四氟乙烯（PTFE）濾膜或者相當者。 5 儀器和設備 5.1 液相色譜儀：配紫外（UV）檢測器或PDA、DAD檢測器。 5.2分析天平：感量0.1 mg。 5.3電子天平：感量0.01 g。 5.4超聲波振蕩器：功率不低于250 W，或相當?shù)脑O備。 5.5組織搗碎機 5.6高速組織勻漿機 5.7渦旋振蕩器 6 測定步驟 6.1 試樣制備、保存 按照GB/T 8855 水果和蔬菜取樣方法。新鮮芒果葉片充分打碎（5.5）、混勻，置于潔凈容器中，密封并做好標記，于–18℃冰箱避光保存。 6.2 提取 芒果葉試樣（6.1）解凍，稱取芒果葉試樣1.00g (精確至0.01g) ，置于100 mL離心管（4.2.1）中，加入提取溶劑70%甲醇溶液（4.1.4）50mL，18 000 rpm高速勻漿1 min（5.6），將樣品轉(zhuǎn)移到250 mL具塞磨口三角瓶（4.2.2）中。分別用40mL、30mL提取溶劑洗滌離心管和刀頭共2次，溶液均合并至三角瓶中。將三角瓶瓶塞蓋上，放入超聲清洗儀（5.4）中，室溫下超聲提取30 min。取出，靜置20min，使分層。將上清轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中（4.2.3），樣品碎渣保留在三角瓶中。三角瓶中加入70%甲醇溶液（4.1.4）100mL，超聲30 min，進行二次提取。容量瓶上放置漏斗，放入脫脂棉，將提取液過濾，濾液合并至250mL容量瓶，用少量70%甲醇溶液（4.1.4）洗滌三角瓶內(nèi)壁與漏斗內(nèi)壁共3次，洗滌液均合并至250mL容量瓶，靜置，樣品溫度冷卻至室溫后，用70%甲醇溶液（4.1.4）定容至250mL，搖勻，得到芒果葉樣品提取液。 以1.0 mL刻度玻璃移液管（4.2.4）吸取樣品提取液1.0mL，放入100mL容量瓶中，用70%甲醇溶液（4.1.4）定容，搖勻。用一次性注射器吸取適量體積樣品溶液，0.22 μm 濾膜過濾（4.2.5），濾液待上機分析。 6.3 樣品測定 6.3.1高效液相色譜參考條件 -液相色譜柱：C18色譜柱,柱長250mm,內(nèi)徑4.6mm,粒徑5μm，或具有同等性能的色譜柱。 -流動相：0.1%甲酸溶液（4.5）+乙腈=85+15（體積比）。 -流速：1 mL/min。 -檢測波長：258 nm。 -進樣體積：10 μL。 -柱溫：25℃。 6.3.2 液相色譜測定 分別取適量的芒果苷系列標準工作溶液（4.1.11）及待上機試樣溶液，按照6.3.1列出的條件進行液相色譜分析測定。由保留時間進行定性，根據(jù)標準工作溶液及芒果苷響應信號，建立標準工作曲線。工作曲線線性相關系數(shù)R2≥0.999。 待測樣液中芒果苷的響應值應在標準曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應稀釋后再進行分析。分析過程中，每20次樣品測定后應加入一個與樣品峰面積相近的標準工作液，如果測得的值與原值相對平均偏差超過5%，則應重新進行標準曲線的制作。標注曲線及典型樣品色譜圖參見附錄A。 7空白試驗 除不加試樣外,均按上述步驟進行。 8 結果計算與表示 8.1 結果計算 試樣中目標物的含量按式(1)計算,計算結果需扣除空白值: (ρ﹣ρ0 )V n m 1 0001 000 X = 100 …………………………………………（1） 式中: X ——試樣中芒果苷的含量,單位為克每百克(mg/100mg); ρ ——樣液中芒果苷的濃度,單位為微克每毫升(μg/mL); ρ0 ——空白中芒果苷的濃度,單位為微克每毫升(μg/mL); V——樣液定容體積,單位為毫升(mL); n——稀釋倍數(shù); m——試樣的質(zhì)量,單位為克(g); 1000———換算系數(shù); 100 ———換算系數(shù)。 8.2 結果表示 測定結果以平均測定的算術平均值表示，計算結果保留兩位有效數(shù)字。兩次平行測定結果的相對平均偏差不應超過5%。 9精密度和回收率 本方法的精密度和回收率實驗結果參見附錄B。 10檢出限 當稱樣量為1g時，芒果苷檢出限為 0.08 mg/g，定量限為 0.25 mg/g。 11檢驗報告 檢驗報告應包括以下內(nèi)容： —識別被測試樣需要的所有信息； —依據(jù)本標準方法（本標準編號）； —芒果苷的測定結果； —實驗日期； —測定人員。 此外，還需說明使用的方法，還應包括本標準未規(guī)定的或選擇頂?shù)臈l件，以及可能影響結果的其他條件。測試報告應包括試樣的唯一性資料。 附 錄 A 色 譜 圖 芒果苷標準物質(zhì)的紫外檢測色譜圖見圖 A.1。 a 圖 A.1 芒果苷對照品紫外檢測色譜圖（1μg/mL） 附錄B 方法的精密度和回收率 表1 方法的精密度和回收率 樣品 添加水平（mg/g） 重復 測定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率 (%) 平均回收率(%) 相對標準偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0.00 0.00 - - - 芒果葉 基質(zhì) （本底） 1 20.48 20.80 - - - 2 20.63 - 3 20.60 - 4 20.98 - 5 21.13 - 6 20.63 - 7 20.75 - 8 20.63 - 9 21.18 - 10 21.05 - 芒果葉 2.50 1 22.88 23.25 83.00 98.10 9.74 2 23.23 97.00 3 23.35 102.00 4 23.23 97.00 5 23.00 88.00 6 23.40 104.00 7 23.45 106.00 8 23.18 95.00 9 23.45 106.00 10 23.38 103.00 芒果葉 5.00 1 25.08 25.06 85.50 85.10 7.31 2 25.25 89.00 3 25.15 87.00 4 25.38 91.50 5 24.48 73.50 6 24.78 79.50 7 25.43 92.50 8 24.93 82.50 9 24.78 79.50 10 25.33 90.50 芒果葉 7.50 1 27.30 27.35 86.67 96.35 7.37 2 26.83 80.33 3 27.85 94.00 4 27.88 94.33 5 27.60 90.67 6 26.83 80.33 7 27.40 88.00 8 28.20 98.67 9 27.00 82.67 10 26.60 77.33