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附件2 保健食品中羅格列酮和格列苯脲的快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法 （KJ201902） 1　 范圍 本方法規(guī)定了保健食品中羅格列酮和格列苯脲的膠體金免疫層析快速篩查方法。 本方法適用于聲稱(chēng)具有輔助降血糖功能的保健食品中羅格列酮和格列苯脲成分的快速篩查。 2　 原理 本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的羅格列酮和格列苯脲等物質(zhì)經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條或檢測(cè)卡中檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)線(xiàn)顏色深淺的變化。通過(guò)檢測(cè)線(xiàn)與控制線(xiàn)（C線(xiàn)）顏色深淺比較，對(duì)樣品中羅格列酮和格列苯脲成分進(jìn)行定性判定。 3　 試劑與材料 3.1　 試劑 除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。 3.1.1　 甲醇：色譜純。 3.1.2　 三羥甲基氨基甲烷，Tris堿。 3.1.3　 濃鹽酸。 3.1.4　 吐溫-20。 3.1.5　 鹽酸溶液：量取濃鹽酸（3.1.3）16.7 mL，用水溶解并稀釋至100 mL。 3.1.6　 緩沖液：稱(chēng)取12.1 g Tris堿（3.1.2），加適量水溶解，混勻，用鹽酸溶液（3.1.5）調(diào)節(jié)pH至8.0，加入5.0 g吐溫-20（3.1.4）攪拌均勻，定容至1000 mL。 3.2　 參考物質(zhì) 參考物質(zhì)的中文名稱(chēng)、英文名稱(chēng)、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見(jiàn)表1，純度均≥99%。 表1 參考物質(zhì)信息表 序號(hào) 中文名稱(chēng) 英文名稱(chēng) CAS登錄號(hào) 分子式 相對(duì)分子量 1 馬來(lái)酸羅格列酮 Rosiglitazone maleate 155141-29-0 C18H17N3O3S 355.41 2 格列苯脲 Glyburide 10238-21-8 C23H28ClN3O5S 494.00 注：或等同可溯源物質(zhì)。 3.3　 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 3.3.1　 羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL）：精密稱(chēng)取適量羅格列酮參考物質(zhì)（3.2），用甲醇（3.1.1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0?mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20℃避光保存，有效期1年。 3.3.2　 羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)工作液（10?μg/mL）：精密移取適量羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0mg/mL）（3.3.1）分別置于10?mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為10?μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20℃避光保存，有效期3個(gè)月。 3.3.3　 格列苯脲標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL）：精密稱(chēng)取適量格列苯脲參考物質(zhì)（3.2），用甲醇（3.1.1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0?mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20℃避光保存，有效期1年。 3.3.4　 格列苯脲標(biāo)準(zhǔn)工作液（10?μg/mL）：精密移取適量格列苯脲標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.3.3）分別置于10?mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為10?μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20℃避光保存，有效期3個(gè)月。 3.4　 材料 羅格列酮膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑（可選），適用基質(zhì)為保健食品。 格列苯脲膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑（可選），適用基質(zhì)為保健食品。 4　 設(shè)備與儀器 4.1　 設(shè)備 4.1.1　 天平：感量為0.1 mg和0.01 g。 4.1.2　 渦旋混合器。 4.1.3　 移液器：20-200 μL，100-1000 μL，5 mL。 4.1.4　 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)4000 r/min以上。 4.2　 儀器 4.2.1　 讀數(shù)儀：產(chǎn)品配套可使用的檢測(cè)儀器（可選）。 4.2.2　 環(huán)境條件：溫度10-40℃，相對(duì)濕度≤80%。 5　 分析步驟 5.1　 試樣制備 液體樣品充分混勻，固體樣品充分粉碎混勻。 5.2　 試樣提取和凈化 5.2.1　 液體基質(zhì) 量取0.5 mL0.02 mL試樣于15 mL離心管中，加入4 mL緩沖液（3.1.6），渦旋混合30 s，作為待測(cè)液。 5.2.2　 固體基質(zhì) 準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣0.5 g0.01 g于15 mL離心管中，加1 mL甲醇（3.1.1），渦旋30 s，4000 rpm離心2 min或靜置2 min。取250 L上清液于2 mL離心管中，加入750 L緩沖液（3.1.6），渦旋混合30s，作為待測(cè)液。 注：試樣提取和凈化（5.2）過(guò)程可按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，不做限定。 5.3　 測(cè)定步驟 5.3.1　 試紙條與金標(biāo)微孔測(cè)定步驟 吸取200 L樣品待測(cè)液于金標(biāo)微孔中，抽吸5-10次使混合均勻，室溫溫育5 min；溫育結(jié)束后，將試紙條吸水海綿端垂直向下插入金標(biāo)微孔中，室溫溫育5 min，從微孔中取出試紙條，去掉試紙條下端的吸水海綿，進(jìn)行結(jié)果判定。 注：測(cè)定步驟建議按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。 5.3.2　 檢測(cè)卡與金標(biāo)微孔測(cè)定步驟 吸取200 μL上述待測(cè)液于金標(biāo)微孔中，上下抽吸5-10次使混合均勻。室溫溫育5 min，將反應(yīng)液全部加入到檢測(cè)卡的加樣孔中，將金標(biāo)微孔中全部溶液滴加到檢測(cè)卡上的加樣孔中，溫育5 min，進(jìn)行結(jié)果判定。 注：測(cè)定步驟建議按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。 5.4　 質(zhì)控試驗(yàn) 每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。 5.4.1　 空白試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取固體空白試樣0.5 g0.01 g或量取液體空白試樣0.5 mL0.02 mL于15 mL離心管中，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。 5.4.2　 加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取固體空白試樣0.5 g0.01 g或量取液體空白試樣0.5 mL0.02 mL于15 mL離心管中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.2），使羅格列酮參考物質(zhì)濃度為1.0 g/g或1.0 g/mL，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。 準(zhǔn)確稱(chēng)取固體空白試樣0.5 g0.01 g或量取液體空白試樣0.5 mL0.02 mL于15 mL離心管中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.4），使格列苯脲參考物質(zhì)濃度為1.0 g/g或1.0 g/mL，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。 6　 結(jié)果判定 通過(guò)對(duì)比控制線(xiàn)（C線(xiàn)）和檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)）的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。目視判定示意圖見(jiàn)圖1。結(jié)果判定也可根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 6.1　 無(wú)效 控制線(xiàn)（C線(xiàn)）不顯色，表明不正確操作或試紙條無(wú)效。 6.2　 陰性結(jié)果 控制線(xiàn)（C線(xiàn)）顯色，檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)）顏色比控制線(xiàn)（C線(xiàn)）顏色深或檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)）顏色與控制線(xiàn)（C線(xiàn)）顏色相當(dāng)，均表示樣品中不含待測(cè)組分或含量低于方法檢測(cè)限，判為陰性。 6.3　 陽(yáng)性結(jié)果 控制線(xiàn)（C線(xiàn)）顯色，檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)）顏色比控制線(xiàn)（C線(xiàn)）顏色明顯淺或檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)）不顯色，均表示樣品中待測(cè)組分含量高于方法檢測(cè)限，判為陽(yáng)性。 6.4　 質(zhì)控試驗(yàn)要求 空白試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。 圖1 目視判定示意圖 7　 結(jié)論 當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。 8　 性能指標(biāo) 8.1　 檢出限 固體樣品1.0 μg/g，液體樣品1.0 μg/mL。 8.2　 靈敏度 靈敏度≥95%。 8.3　 特異性 特異性≥90%。 8.4　 假陰性率 假陰性率≤5%。 8.5　 假陽(yáng)性率 假陽(yáng)性率≤10%。 注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見(jiàn)附錄A。 9　 其他 本方法分析步驟和結(jié)果判定可以根據(jù)廠(chǎng)家試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，但應(yīng)符合或優(yōu)于本方法規(guī)定的性能指標(biāo)。 本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做限定。但方法使用者應(yīng)使用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的滿(mǎn)足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)的試劑、試劑盒。 本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS201710《保健食品中75種非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)》、藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法2009029《降糖類(lèi)中成藥中非法添加化學(xué)藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法》。 本方法使用羅格列酮試劑盒可能與吡格列酮存在交叉反應(yīng)；格列苯脲試劑盒可能與格列美脲、格列齊特、格列吡嗪、格列喹酮、甲苯磺丁脲存在交叉反應(yīng)；當(dāng)結(jié)果判定為陽(yáng)性應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。 - 9 - 附錄A 定性方法性能指標(biāo)計(jì)算表 表A.1性能指標(biāo)計(jì)算方法 樣品情況a 檢測(cè)結(jié)果b 總數(shù) 陽(yáng)性 陰性 陽(yáng)性 N11 N12 N1.=N11+N12 陰性 N21 N22 N2.=N21+N22 總數(shù) N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 顯著性差異（c2） c2=（N12-N21-1）2/（N12+N21）， 自由度（df）=1 靈敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特異性（p-，%） p-=N22/N2. 假陰性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-靈敏度 假陽(yáng)性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特異性 相對(duì)準(zhǔn)確度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注： a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果； b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。 N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 C為方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測(cè)趨勢(shì)情況綜合評(píng)價(jià)。 本方法負(fù)責(zé)起草單位：廣東省食品檢驗(yàn)所。 驗(yàn)證單位：江蘇省南通市食品藥品監(jiān)督檢測(cè)中心、南京工業(yè)大學(xué)。 主要起草人：汪廷彩、蔡若純、劉海虹、雷毅。 — END —