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過氧化物酶(POD)同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳 一、目的 1、了解聚丙烯酰胺凝膠電泳原理。 2、了解聚丙烯酰胺凝膠的制作過程。 3、了解過氧化物酶同工酶電泳過程。 二、實驗原理： 1、聚丙烯酰胺凝膠電泳原理及影響電泳的主要因素 帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。用電泳技術(shù)分離、分析蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子，有較高的分辨率，目前已成為生物科學研究中必不可少的手段之一。 帶電離子在電場中的泳動速度（1）和遷移率（泳動度）（2） V= Eqa (1) 6πrη u= qa (2) 6πrη 由（2）式可以看出，凡能影響溶液粘度η的因素如溫度，影響分子帶電量q及解離度a的因素如pH的改變，都會對遷移率產(chǎn)生影響。因此，電泳應盡可能在恒溫條件下進行。并選用一定pH的緩沖液。同時，所選用的pH以能擴大各種被分離物質(zhì)所帶電荷量的差異為好，以利于分離各種成分。遷移率與粒子的大?。╮）有關(guān)，非球形粒子（如DNA）在電泳過程中會受到更大的阻力，即粒子的移動速度還與粒子形狀有關(guān)。 另外，遷移率還受電滲現(xiàn)象的影響。所謂電滲是指在電場中，液體對于固體支持物的相對移動。例如在紙電泳中，由于濾紙（纖維素）上帶有負電荷，因感應相吸而使與濾紙相接觸的水溶液帶正電荷，從而使液體向負極移動，帶動著本來是向負極泳動的物質(zhì)以更快的速度移動。因此，電泳時應避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)中不帶電荷，在電場中電滲現(xiàn)象極為微小。這些特點，使得聚丙烯酰胺凝膠適合作區(qū)帶電泳的支持介質(zhì)。最后，要考慮選用離子強度適宜的溶液。一般低離子強度比較合適，因為此時導電性低，產(chǎn)生的熱量較少。同時可使被分離的帶電離子對電流貢獻最大從而加快電泳速度。但也不能過低，它必須可以緩沖被分離樣品中帶電離子對凝膠pH的影響，且過低的離子強度易導致蛋白質(zhì)凝聚。一般最適的離子強度在0.01～0.1mol/L之間。最常見的為0.05。在稀溶液中，離子強度Ⅰ可用下式計算：Ⅰ＝1/2ΣmiZi2 (3) （3)式中，mi為離子的摩爾濃度，Zi為離子的價數(shù)。 （1）式中泳動速度V除了上述影響因素外，還與電場強度E成正比。 2、聚丙烯酰胺凝膠 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳。這種凝膠是以丙烯酰胺單體（Acrylamide，簡寫為Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（N,N-Methylena Bisacrylamide，簡寫為Bis）在催化劑的作用下聚合而成的。Acr和Bis在它們單獨存在或混合在一起時是穩(wěn)定的，且具有神經(jīng)毒性，操作時應避免接觸皮膚。但在具有自由基團體系時，它們聚合。引發(fā)產(chǎn)生自由基團的方法有兩種，即化學法和光化學法。 化學聚合的引發(fā)劑是過硫酸銨 (NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，簡寫為Ap），催化劑是N，N，N,N-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，簡寫為TEMED）。在催化劑TEMED的作用下，由過硫酸銨（Ap）形成的自由基又使單體形成自由基，從而引起聚合作用。冷卻可使聚合速度變慢；一些金屬抑制聚合；分子氧阻止鏈的延長，防礙聚合作用。這些因素在實際操作時都應予以控制。 光聚合以光敏感物核黃素（即VB2）作為催化劑，在痕量氧存在下，核黃素經(jīng)光解形成無色基，無色基被氧再氧化成自由基，從而引起聚合作用。 聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)，為丙烯酰胺單位構(gòu)成的長鏈，鏈與鏈之間通過甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起。鏈的縱橫交錯，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠具有分子篩性質(zhì)。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品的擴散運動，使凝膠具有良好的抗對流作用。此外，長鏈上富含酰胺基團，使其成為穩(wěn)定的親水凝膠。 聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量主要由凝膠濃度和交聯(lián)度決定。每100mL凝膠溶液中含有的單體（Acr）和交聯(lián)劑（Bis）總克數(shù)稱為凝膠濃度，用T％表示。凝膠溶液中，交聯(lián)劑（Bis）占單體（Acr）和交聯(lián)劑（Bis）總量的百分數(shù)稱為交聯(lián)度，用C％表示。改變凝膠濃度以便適應各種樣品的分離。一般常用7.5％濃度的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，而用2.4%的分離核酸。但根據(jù)蛋白質(zhì)與核酸分子量不同，適用的濃度也不同（見表1）。 表1 凝 膠 濃 度 選 用 表 物 質(zhì) 分 子 量 范 圍 適用的凝膠濃度(%) 蛋 白 質(zhì) ＜104 20～30 1104～4104 15～20 4104～1105 10～15 1105～5105 5～10 ＞5105 2～5 核 酸 ＜104 15～20 104～105 5～10 105～2106 2～2.6 3、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理 系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面： （1）凝膠板由上、下兩層膠組成，兩層凝膠的孔徑不同。上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。 濃縮膠：又稱堆積膠。凝膠濃度較小，孔徑相對較大。把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用樣品被濃縮成一個狹窄的區(qū)帶，使樣品組分在分離膠中得以高分辨率的被分離。 分離膠:又稱電泳膠，通?？讖捷^小，通過選擇合適的凝膠濃度，使樣品組分得以很好地分離。分離膠又分為均一膠和梯度膠。 （2）緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。本實驗采用堿性系統(tǒng)。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液。而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。 （3）在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應，即電荷效應、分子篩效應和濃縮效應。在這三種效應的共同作用下，待測物質(zhì)被很好地分離開來。下面以本實驗要分離的豆芽或土豆過氧化物酶同工酶為例，分別說明三種效應的作用： （1）電荷效應：各種酶蛋白按其所帶電荷的性質(zhì)及數(shù)量，在電場作用下向一定電極，以一定速度泳動。 （2）分子篩效應：分子量小，形狀為球形的分子在電泳過程中受到阻力較小，移動較快；反之，分子量大、形狀不規(guī)則的分子，電泳過程中受到的阻力較大，移動較慢。這種效應與凝膠過濾過程中的情況不同。 （3）濃縮效應：待分離樣品中的各組分在濃縮膠中會被壓縮成層，而使原來很稀的樣品得到高度濃縮。其原因如下： ① 由于兩層凝膠孔徑不同，酶蛋白向下移動到兩層凝膠界面時，阻力突然加大，速度變慢。使得在該界面處的待分離酶蛋白區(qū)帶變窄，濃度升高。 ② 在聚丙烯酰胺凝膠中，雖然濃縮膠和分離膠用的都是Tris-HCl緩沖液，但上層濃縮膠為pH 6.7，下層分離膠為pH 8.9。HCl是強電解質(zhì)，不管在哪層膠中，HCl幾乎都全部電離，Cl－布滿整個膠板。待分離的酶蛋白樣品加在樣品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸緩沖液中。電泳一開始，遷移率最大的Cl－迅速跑到最前邊，成為快離子（前導離子）。在pH6.7條件下解離度僅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）遷移率最低，跑在最后邊，成為慢離子（尾隨離子）。這樣，快離子和慢離子之間就形成了一個不斷移動的界面。在pH6.7條件下帶有負電荷的酶蛋白，其遷移率介于快慢離子之間，被夾持分布于界面附近，逐漸形成一個區(qū)帶。 由于快離子快速向前移動，在其原來停留的那部分地區(qū)成了低離子濃度區(qū)，即低電導區(qū)。因為電位梯度V、電流強度I和電導率S之間有如下關(guān)系： V＝I/S (4)所以在電流恒定條件下低電導區(qū)兩側(cè)就產(chǎn)生了較高的電位梯度。這種在電泳開始后產(chǎn)生的高電位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢離子加速前進，追趕快離子。本來夾在快慢離子之間的酶蛋白區(qū)帶，在這個追趕中被逐漸地壓縮聚集成一條更為狹窄的區(qū)帶。這就是所謂的濃縮效應。 當酶蛋白和慢離子都進入分離膠后，pH從6.7變?yōu)?.9，甘氨酸解離度劇增，遷移率迅速加大，從而趕上并超過所有酶蛋白分子。此時，快慢離子的界面跑到被分離的酶蛋白之前，不連續(xù)的高電位梯度不再存在。于是，此后的電泳過程中，酶蛋白在一個均一的電位梯度和pH條件下，僅按電荷效應和分子篩效應而被分離。與連續(xù)系統(tǒng)相比，不連續(xù)系統(tǒng)的分辨率大大提高，因此已成為目前廣泛使用的分離分析手段。 4、過氧化物酶同工酶電泳 同工酶是指其催化的化學反應相同，而酶的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫性質(zhì)不同的一組酶。植物在發(fā)育過程中，所含同工酶的種類和比例都不相同，它們與植物的遺傳、生長發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)及抗性等都有一定關(guān)系，因此作為基因表達的產(chǎn)物，測定同工酶譜是認識基因存在和表達的一種工具，在植物的種群、發(fā)育及雜交遺傳的研究中有重要的意義。 過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化，測定這種酶的活性或其同工酶，可以反映某一時期植物體內(nèi)代謝的變化。 利用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定同工酶，方法簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性強，測定結(jié)果便于觀察、記錄和保存。本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)，分離、鑒定土豆、豆芽過氧化物酶同工酶。 同工酶染色：根據(jù)酶的生物化學反應，通過染色方法顯示出酶的不同區(qū)帶。過氧化物酶能催化過氧化氫使聯(lián)苯胺氧化成藍色或棕色產(chǎn)物，據(jù)此即可將該酶在凝膠中顯色定位。 三、實驗材料、儀器與試劑 1、材料 土豆和豆芽 2、儀器： DYCZ-24E電泳槽、DYY-11型和DYY-12型三恒多用電泳儀、臺式高速離心機、微量進樣器、芬蘭可調(diào)移液器，研缽，50mL燒杯，量筒、大培養(yǎng)皿等玻璃器皿。 3、試劑： 電泳試劑貯存液配置見附表(附表1)。 染色液成分：抗壞血酸70.4mg,聯(lián)苯胺溶液(2g聯(lián)苯胺溶于18mL溫熱冰醋酸中,再加入蒸餾水72mL)20mL,0.6%(或1.2%)過氧化氫20mL,蒸餾水60mL。 四、實驗步驟： 1.安裝制膠模具（教師演示，學生安裝） 注意事項：在整個過程中要輕拿輕放，以免將玻璃板弄碎。 2.制作分離膠(濃度10%) 分離膠配方(濃度10%):pH8.9 Tris-HCl溶液:0.8mL 分離膠PAG溶液:1.2mL 蒸餾水:1.6mL 10%TEMED:40μl 10%AP: 40μl 將上述溶液充分混勻,立即全部倒入安裝好的制膠玻板中,為使分離膠界面平整,可在倒入分離膠后約5min后在其表面沿高板緩慢均勻加入0.5mL蒸餾水并將電泳槽輕輕敲擊桌面。再靜置40min左右,讓分離膠凝聚完全。 3.制作濃縮膠(濃度2.4%) 濃縮膠配方(濃度2.4%):pH6.7 Tris-HCl溶液:0.42 mL 濃縮膠PAG溶液:1.25mL 40%蔗糖溶液:1.25mL 10%TEMED:30μl 10%AP: 30μl 將上述溶液充分混勻,在聚合完全的分離膠上,倒入濃縮膠,（注意在倒入濃縮膠前要去掉分離膠表層的水）同時插入梳子,直到溶液裝滿和梳子插平為止。再靜置40min左右,濃縮膠聚合完全后為乳白色。 注意事項：A、在整個過程中要將制膠模具垂直放在桌面上，不容許傾斜。B、充分混勻的（分離膠或濃縮膠）溶液應盡快用移液槍延高板的一側(cè)慢慢加入膠板中 C、膠制作完成后，松開卡板取下橡膠皮，然后再用卡板卡緊膠板。要注意低板在內(nèi)側(cè)。 4.制樣 取適量(2g)的馬鈴薯于研缽中,加1mL的PBS(磷酸緩沖液,pH7.4),于冰上研磨至勻漿狀,收集在1.5mL的離心管中,在臺式離心機中以8000rpm離心5min，取上清,即為粗酶提取液,其中含有所需的POD。另外,豆芽研磨可取4g左右,同樣加入1mL的PBS。 5.點樣 在濃縮膠聚合完畢后,小心取出梳子,兩拇指和食指捏住梳子的柄,其余三指頂住制膠框兩側(cè),勻速地拔出梳子,然后向電泳槽中倒入預冷的電極緩沖液（原液要稀釋10倍）,緩沖液要沒過低板。 點樣前,要對樣品進行預處理,即把粗酶提取液與甘油溴酚藍指示劑以4:1混合,用50μl的微量點樣器吸取樣品20μl,將點樣器的針頭小心插入到點樣孔底部,慢慢注入樣品,要注意防止漂樣。 6.電泳 點樣完畢后,連接好導線(正負電極不要接反,紅色為正極,黑色為負極),將電壓調(diào)至70 V,當溴酚藍標志線移至濃縮膠與分離膠分界處,將電壓調(diào)至150V,電泳2-3小時,當溴酚藍標志線剛好跑出膠板時,結(jié)束電泳。 7.取膠 切斷電源,取出緩沖液并低溫保存,可重復使用2次。然后松開卡板，取出凝膠板,用解剖刀扁平部分插入玻板的一角(是分離膠的一角),輕輕撬去一塊玻板,用刀切掉分離膠右下角以示點樣順序,輕輕撬起分離膠,使之滾入染色培養(yǎng)皿中。 8.染色 POD染色步驟如下：先用自來水溶液潤洗兩遍,再加入30-40mL的染色液,室溫下放置5-20min,至顯色完全。 9.清洗玻璃板、膠皮、電泳槽。 五、注意事項： 1.在整個清洗過程中要輕拿輕放，以免將玻璃板弄碎。同時，清洗玻璃板不容許用強酸、強堿以及酒精溶液，一般用清水加一點洗滌劑進行清洗，然后用去離子水或蒸餾水潤洗。 2.在整個實驗過程中，要注意實驗安全，凝膠、聯(lián)苯胺等試劑有毒，應戴乳膠手套或一次性手套操作。 3.在電泳過程中不允許用手去觸摸電極緩沖液，以免觸電。 附表1 試劑 配方 分離膠PAG溶液 丙烯酰胺 (Acr):30g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis):0.8g 加水定容至100mL Tris-HCl緩沖液(pH8.9) Tris:36g HCl(12mol/L):2mL 加水定容至100mL 濃縮膠PAG溶液 Acr:5.0g Bis:1.25g 加水定容至50mL Tris-HCl緩沖液(pH6.7) Tris:3g HCl(12mol/L):2mL 加水定容至50mL 40%蔗糖溶液 蔗糖:20g 加水定容至50mL 10% TEMED 溶液 四甲基乙二胺(TEMED):10mL 加水定容至100mL(避光、低溫保存) 10%過硫酸胺(AP)溶液 AP:0.5g H2O:5mL (避光、低溫保存,一周內(nèi)可多次使用) 甘油溴酚藍指示劑 溴酚藍:0.01g H2O:5mL 甘油:5mL 電極緩沖液(pH 8.3) Tris:6.0g 甘氨酸(Gly):28.8g 加水定容至1000mL,使用時稀釋10倍 0.2mol/L PBS溶液(pH7.8) 按照有關(guān)參考書配置