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笫八部分 聚丙烯酰胺凝膠電泳 一、電泳的原理 電泳(electrophoresis)是指帶電顆粒在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。在生物化學及分子生物學中，主要是根據(jù)生物大分子所帶電荷的數(shù)量及其在分子表面排布的不同來對它們進行分離和鑒定。電泳現(xiàn)象早在1809年就被發(fā)現(xiàn)，但將這種現(xiàn)象用于生物化學領(lǐng)域卻萌芽于十九世紀初，1907年，有人曾研究過白喉毒素在瓊脂中的電泳；1937年，瑞典的Tiselius建立了“移界電泳法”(moving boundary EP),成功地將血清蛋白質(zhì)分成5個主要成分，即清蛋白、α1-、α2-、β-和γ-球蛋白。其后的幾十年，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生。以所采用的固體支持物區(qū)分，有紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、纖維素或淀粉粉末電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳 表1 電泳技術(shù)的種類 類 別 名 稱 型 式 不用支持體的 電泳技術(shù) 1． 1． Tiselleas式微量電泳 2． 2． 顯微電泳 3． 3． 等電點聚焦電泳 4． 4． 等速電泳 5． 5． 密度梯度電泳 屬自由電泳 用支持體的 電泳技術(shù) 1． 1． 紙上電泳 2． 2． 醋酸纖維薄膜電泳 3． 3． 薄層電泳 4． 4． 非凝膠性支持體區(qū)帶電泳支持體有：淀粉、纖維素粉、玻璃粉硅膠、合成樹脂粉末 5． 5． 凝膠支持體區(qū)帶電泳 (1)淀粉膠 (2)聚丙烯酰胺 ①圓盤電泳法 ②平板法 ③SDS-凝膠電泳法 (3)瓊脂糖凝膠電泳 (4)瓊脂凝膠電泳 包括常壓、高壓電泳 (水平式或垂直式) 水平式或垂直式 (平板法、柱形法及線絲法) 垂直式(柱形法) 垂直式或水平式 垂直式(測分子量) 平板法或柱形法 (如免疫電泳) 其他用法 1． 1． 雙向電泳 2． 2． 電泳—層析相結(jié)合 3． 3． 交叉電泳紙 4． 4． 連續(xù)低電泳 等；以電泳形式區(qū)分，有在液體介質(zhì)中進行的，有將支持物做成薄膜或薄層的，有板形或柱形的等(表1)。電泳由于與光學裝置、自動記錄儀及自動部分收集器結(jié)合，又組成了等電點聚焦儀、等速電泳儀等等，80年代末發(fā)展起來的毛細管電泳(capillary electrophoresis)是在毛細管中裝入緩沖液，在其一端注入樣品，在毛細管兩端加直流高電壓實現(xiàn)對樣品的分離…… 這些都極大地發(fā)展和擴大了電泳技術(shù)的應(yīng)用范圍。 電泳按其分離的原理大致可分為四類：區(qū)帶電泳(zone EP，ZEP)、移界電泳(moving boundary EP，MBEP)、等速電泳(isotachophoresis，ITP)和等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)。現(xiàn)將各種電泳分離原理簡單介紹如下： 1．區(qū)帶電泳 如圖1(a)所示，不同的離子成分在均一的緩沖液系統(tǒng)中分離成獨立的區(qū)帶，可以用染色等方法顯示出來，用光密度計掃描可得到一個個互相分離的峰。電泳的區(qū)帶隨時間延長和距離加大而擴散嚴重，影響分辨率。加不同的介質(zhì)可減少擴散，特別是在凝膠中進行，它兼具分子篩的作用，分辨率大大提高，是應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。 2．移界電泳 如圖1(b)所示，它只能起到部分分離的作用，如將濃度對距離作圖，則得到一個個臺階狀的圖形，最前面的成分有部分是純的，其他則互相重疊。各界面可用光學方法顯示，這就是Tiselius最早建立的電泳方法。 3．等速電泳 如圖1(c)所示，在電泳達成平衡后，各區(qū)帶相隨，分成清晰的界面，以等速移動。按距離對濃度作圖也是臺階狀，但不同于上述移界電泳，它的區(qū)帶沒有重疊，而是分別保持。 4. 等電聚焦 如圖1(d)所示，由多種具有不同等電點的載體兩性電解質(zhì)在電場中自動形成PH梯度，被分離物則各自移動到其等電點而聚成很窄的區(qū)帶，分辨率很高。 a b c d 圖1 不同電泳法的分離原理示意圖 a．區(qū)帶電泳；b．移動界面電泳；c．等速電泳；d．等電聚焦 電泳技術(shù)由于具有快速、簡便及高分辨率等優(yōu)點，其應(yīng)用十分廣泛。從分離與分析無機離子到復雜的生物高分子化合物，以及在放射化學和免疫化學中都占有重要的地位；在生化實驗室和生化工業(yè)方面應(yīng)用更為普通；醫(yī)藥部門還用作臨床診斷。在各類電泳技術(shù)中，尤以凝膠電泳在分離分析酶、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子等方面分辨力為最高，為生物化學，分子生物學的發(fā)展作出了重大貢獻。本文主要介紹聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理與技術(shù)。 (一)遷移率(泳動度) 1．電泳速度 設(shè)溶液中有一帶有正電荷Q的顆粒，在強度為E的電場影響下移動，帶電顆粒所受的力為F＝QE。同時此顆粒的移動受到方向相反的摩擦力F1＝f v的阻礙，f代表摩擦系數(shù)，v代表速度。當這兩種力相等時，顆粒以速度v向前遷移(圖2)。即 QE＝f v………………………………………………………………………(1) F′=fv F =QE Q H v + _ v＝QE/f………………………………………………………………………(2) 圖2 帶電顆粒在電場中遷移的受力情況 摩擦系數(shù)f和擴散系數(shù)D的關(guān)系為 f＝KT/D………………………………………………………………………(3) 其中K為布氏常數(shù)，T為絕對溫度，因此可以從顆粒的擴散系數(shù)求出。 根據(jù)Stoke定律，一球形分子在溶液中泳動所受的阻力 F1＝6πrηV…………………………………………………………………(4) r為顆粒半徑，η為介質(zhì)粘度，v為泳動速度。 (4)式同F(xiàn)1 ＝ f V式比較可得： f＝6πrη……………………………………………………………………(5) (5)式代入(2)式得： V＝QE/6πrη……………………………………………………………… (6) 由(6)式可知，帶電顆粒在電場中的電泳速度v與其所帶電荷Q，電場強度E成正比，與顆粒半徑r大小，液體粘度系數(shù)η成反比。即在同一電場同一介質(zhì)中的顆粒，如帶電荷數(shù)不同或顆粒大小不同, 則各自電泳速度不同，因而電泳能使各顆粒分開。 2．遷移率 顆粒在電場中移動的快慢一般不用電泳速度來表示。因為同一顆粒在不同電場中其電泳速度是不同的，由(2)式或(4)式可見速度是電場強度的函數(shù)，V ＝ f(E),用v不能反映顆粒本身的特性。因此，顆粒移動快慢通常用遷移率μ或m來表示。泳動度為帶電顆粒在單位電場強度下的電泳速度。即: μ＝v/E＝(d/t)/(V/l) ＝dl/Vt(cm2v-1s-1) ……………………………(7) d為顆粒泳動距離(cm),l為支持物的有效長度(cm),V為加在支持物兩端的實際電壓(v), t為通電時間(s) (6)式代入(7): μ＝Q/6πrη……………………………………………………………………(8) 由(8)式可見，遷移率與帶電顆的帶電荷數(shù)，半徑、介質(zhì)粘度有關(guān)，而與電場強度無關(guān)。所以說，在確定條件下，某物質(zhì)的遷移率為常數(shù)，是該物質(zhì)的物化特性常數(shù)。 3．有效遷移率 由遷移率的定義式μ＝v/E 可得 v ＝μ E…………………………………………………………………………(9) 即電泳速度與遷移率和電場強度成正比。 由于電解質(zhì)在溶液中不同程度的電離對離子遷移速度影響較大，因此，在實際電泳過程中，離子在電場力作用下電流速度是由下式?jīng)Q定的。 v ＝αμE………………………………………………………………………(10) 式中α是電離度，μ是離子遷移率，αμ稱為有效遷移率。顯然，帶電顆粒的有效遷移率大，其電泳速度也就大。 離子有效遷移率在討論聚丙烯酰胺凝膠電泳時是一個很有用的物理量。因為在粗孔膠中為了保證蛋白質(zhì)p夾在先行離子Cl-和隨后離子甘氨酸根G-之間使蛋白質(zhì)樣品濃縮、壓成薄片就必須對粗孔膠設(shè)計一個緩沖體系，以使得它維持的PH值所造成的離子解離度，剛好滿足如下關(guān)系，即 αC1- m C1- ＞αP- m P- ＞αG- m G- 這就是電場強度相同時離子在粗孔膠中實際遷移的順序。式中的m就是離子遷移率u，之所以變更符號，其原因是它所用的單位常以10-5cm2V-1s-1為一個m單位。 當分離成分電泳到細孔膠后，由于要使蛋白質(zhì)在這一分離膠中分開成區(qū)帶，而不使甘氨酸根影響蛋白質(zhì)的分離，因此需要設(shè)計另一個PH緩沖體系，使之滿足 αC1- m C1-＞αG mG＞ αP- m P- 這時隨后離子一躍而起超過各種蛋白質(zhì)。 (二)影響電泳的外界因素 電泳速度除受顆粒本身的性質(zhì)如帶電性，直徑大小等影響外，還受其他外界因素的影響。 1. 1. 電場 (1) (1) 電場強度(電勢梯度) 電場強度是指單位長度上的電壓降(v/cm)。由(2)式見，電場強度E對泳動速度起著十分重要的作用，電場強度越大，電泳速度越快，單位時間內(nèi)顆粒遷移的距離就越大，電泳時間就可縮短。根據(jù)電場強度的大小可將電泳分為二類：常壓電泳(100～500v)與高壓電泳(500～1000v),前者電場強度一般為2～10v/cm，后者為20～200v/cm，常壓電泳分離時間長，需數(shù)小時到數(shù)天，多用于分離大分子物質(zhì)，高壓電泳分離時間短，有時僅需數(shù)分鐘，多用于分離小分子物質(zhì)。 在實際工作中有時需要進行快速電泳，如果沒有高壓電泳設(shè)備，人們往往利用上述原理，把常壓電泳槽小型化，縮短支持介質(zhì)的兩端距離。例如將原來兩端相距20cm 改為5cm，此時外加電壓雖仍是200v，但電場強度則從10v/cm變?yōu)?0v/cm，這就加快了電泳速度。有時為了使樣品遷移率放慢，也可調(diào)小電壓，降低電勢梯度。 (2)電極及電極反應(yīng) 電泳的電極材料大都選用鉑金絲，鉑金絲的安放位置影響電場強度。如兩極間鉑金絲位置放得不好，電場強度不均勻，常會使電泳譜帶彎曲或同一樣品的遷移速率不一樣。 通電過程中電極二端會發(fā)生電解反應(yīng)： 正極(氧化極)H2O→2H++1/2O2↑+2e-　 負極(還原極)2H2O+2e-→2OH-+H2↑　 因此在電泳過程中，正負極均可看到氣體產(chǎn)生(負極有密集的氫氣泡，正極有較大的氧氣泡)，電泳過后，兩個電泳槽的PH可相差很大(2～4個PH)。另外電泳過程中會產(chǎn)生熱量，尤其是高壓電泳，因此高壓電泳槽要附有冷卻設(shè)備，常壓電泳可放在冰箱中降溫。 2.緩沖液 緩沖液的成分及濃度決定并穩(wěn)定著支持介質(zhì)的PH和溶液的離子強度，并影響著帶電顆粒的遷移率。 (1) (1) 成分 通常電泳用的緩沖液有：巴比妥(鈉)；硼酸(鈉)；磷酸鹽；Tris等。要根據(jù)電泳類型和對象選用緩沖液成分，例如用紙電泳分離血清蛋白可選用巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，而聚丙烯酰胺凝膠電泳分離酶?？捎肨ris-甘氨酸緩沖液……。緩沖液成分總的要求：不使樣品變性，不改變支持物的理化性質(zhì)，不影響電泳后染色，有利于電泳的進行及樣品的分離。 (2)濃度 主要影響溶液的離子強度(μ)。離子強度是離子濃度(Ci)和離子價數(shù)(zi)的函數(shù)μ＝f(ci、zi)稀溶液的離子強度可用下式計算 μ＝1/2Σ1SCiZi2 式中s表示共有s種離子；Ci為離子的摩爾濃度；zi為離子價數(shù)。例如0.01mol/L Na2SO4加0.02mol/L NaCl溶液的離子強度應(yīng)為： μ＝1/2(0.0112+0.0122+0.0212+0.0212) ＝0.045 離子強度越高，顆粒的遷移速度就越慢。在電解質(zhì)溶液中，帶電荷的顆粒能把一些帶有相反電荷的離子吸引在其周圍，形成一個離子擴散層。一方面影響顆粒所帶的電荷，降低其在電場中的電場力F，從而影響遷移速度(式2)；另一方面，當加以電場時，顆粒向與其電荷相反的電極移動，即帶正電荷顆粒移向負極，帶負電荷顆粒移向正極，離子擴散層由于攜帶過剩的與顆粒符號相反的電荷，則向相反方向移動，結(jié)果因顆粒與離子擴散層之間的靜電引力，使顆粒遷移速度減慢。上述(8)式是由理想的絕緣體系推導的，如果考慮離子強度的影響： μ＝(Q/6πrη)/(1+kμ1/2r) k為常數(shù)，25℃,k＝0.33103,μ為離子強度。 緩沖溶液濃度低時，離子強度減少，會影響溶液的導電性，樣品分子擴散加重，分辨率下降。因此緩沖液的離子強度應(yīng)有個適宜的范圍，一般控制在0.02～0.2之間。 (3)PH 溶液的PH值決定了帶電顆粒解離的程度，決定了物質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量，也決定了樣品的遷移方向。以蛋白質(zhì)為例，當溶液的PH低于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)分子帶正電荷成為陽離子；當溶液PH大于等電點時，蛋白質(zhì)分子帶負電荷，成為陰離子，PH值離等電點越遠，顆粒所帶凈電荷越多，遷移速度越快，反之越慢。圖3表示了不同PH條件下，蛋白質(zhì)分子帶電荷情況及其在電場中運動狀態(tài)。 PH -H+ +H+ PH＜PI -H+ +H+ PH＝PI PH＞PI 蛋白分子的電荷 +H3N-R-COOH +H3N -R-COO- H2N-R-COO- 離子形式 陽離子 兩性離子 陰離子 在電場中的遷移方向 向陰極 不遷移 向陽極 圖3 蛋白質(zhì)分子在不同PH條件下所帶電荷及其在電場中遷移方向的示意圖 因此，當分離某一蛋白質(zhì)混合物時，應(yīng)選擇一種能擴大各種蛋白質(zhì)所帶電荷量差異的PH緩沖液。電泳時，正負電極接線也要隨PH變化而變化，例如在堿性條件下，蛋白質(zhì)帶負電荷，正極應(yīng)接在遠離加樣品的一方，以使蛋白質(zhì)在支持物上定向遷移。 3．支持物 多數(shù)電泳都有支持物，如紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳，然而支持物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)對帶電顆粒的遷移率有很大影響，主要表現(xiàn)為對樣品的吸附，產(chǎn)生電滲與分子篩效應(yīng)。 支持物對樣品的吸附，使帶電顆粒泳動過程中，摩擦力增加，一方面降低了遷移速度，另一方面導致樣品拖尾，故使分辨率下降。 在電場中液體對于團體支持物的相對移動稱為電滲。例如在紙電泳中，由于組成紙的纖維素帶負電荷，因感應(yīng)相吸而使與紙相接觸的水層帶正電荷(H3O+)，使溶液在電場作用下向負極移動，并帶動物質(zhì)向負極移動。如果樣品原來帶正電荷應(yīng)向負極移動，結(jié)果由于電滲使樣品移動得更快，反之就會變慢，甚至倒退。用PH 8.6的巴比妥緩沖液進行血清紙電泳，在這PH下蛋白質(zhì)帶負電荷應(yīng)向正極移動，可是r-球蛋白卻移向負極，這就是電滲造成的，因為這時溶液向負極流動，對蛋白質(zhì)顆粒泳動起阻礙作用，又加上r-球蛋白分子顆粒較大，移動慢，電滲作用大于顆粒的泳動力，結(jié)果使顆粒后退。紙和淀粉等支持物電滲作用明顯，醋酸纖維和聚丙烯酰胺凝膠電滲較小。 分子篩是凝膠電泳的一個特性，用來作電泳的凝膠通常具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且具有彈性的半固體物質(zhì)，具有分子篩作用，使小顆粒易透過，而大顆粒不易通過，凝膠的分子篩效應(yīng)對分離樣品是有利的。 二、聚丙烯酰胺凝膠的合成、結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 1.合成 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體(Acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N1，N1-甲叉雙丙烯酰胺(N，N-methylene bisacrylamide,簡稱Bis)在催化劑的作用下聚合而成的含酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈，相鄰的兩個鏈通過甲叉橋交鏈起來，鏈縱橫交錯，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠(圖4)。參與反應(yīng)的催化劑有二種成分。一是引發(fā)劑，它提供原始自由基，通過自由基傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動聚合反應(yīng)；二是加速劑，它加快引發(fā)劑釋放自由基速度。表2是常用引發(fā)劑與加速劑的搭配。過硫酸銨和核黃素分別引發(fā)二種不同類型的反應(yīng)。 表2 聚合反應(yīng)催化劑的搭配 引發(fā)劑 加速劑 引發(fā)反應(yīng) (NH4)2S2O3 (NH4)2S2O3 核 黃 素 TEMED DMAPN TEMED 化學聚合 化學聚合 光聚合 TEMED，N，N，N1，N1-tetramethy1ethylenediamine N,N,N1N1-四甲基乙二胺； DMAPN，3-dimethylaminpropionitrile,3-二甲基氨丙腈 化學聚合：過硫酸銨在TEMED或DMAPN的催化下形成氧自由基，進而使單體形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。聚丙烯酰胺凝胺的分離膠(小孔膠)，就是通過這種化學聚合而合成的。 光聚合：核黃素在光下形成無色基，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合反應(yīng)。但過量的氧會阻止鏈長的增加。此法比上法制得凝膠的膠孔大，因此常作電泳中的濃縮膠。 以上的聚合反應(yīng)，受許多因素的影響。 (1)大氣氧能淬滅自由基，終止聚合反應(yīng)，所以反應(yīng)液應(yīng)當與空氣隔絕。 (2)有些材料，如有機玻璃能抑制聚合反應(yīng)，在有機玻璃容器中，反應(yīng)液和容器表面接觸的一層，不能形成凝膠。 (3)某些化學物質(zhì)可以減慢反應(yīng)速度，如鐵氰化鉀。 (4)溫度影響聚合反應(yīng)，溫度高，反應(yīng)快；溫度低，反應(yīng)慢。 因此在設(shè)計電泳器和制備凝膠時，要注意這些因素的影響。 圖4 丙烯酰胺，N’,N’-甲叉雙丙烯酰胺和聚丙烯酰胺的化學結(jié)構(gòu)式 2．凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系 為了使樣品分離得快，操作方便，便于記錄結(jié)果和保存樣本，要求凝膠有一定的物理性質(zhì)，合適的篩孔，一定的機械強度，良好的透明度。這些性質(zhì)很大程度上是由凝膠濃度和交聯(lián)度所決定的。 100ml凝膠溶液中含有的單體和交聯(lián)劑總克數(shù)稱為凝膠濃度，記號為T。 T(%)＝［Acr(g)+Bis(g)］/V(ml)100% 凝膠溶液中，交聯(lián)劑占單體加交聯(lián)劑總量的百分數(shù)為交聯(lián)度，記號為C。 C(%)＝Bis/(Acr+Bis)100% 凝膠濃度能夠在3%～30%中變化，濃度過高時，凝膠硬而脆，容易破碎；濃度太小，凝膠稀軟，不易操作。凝膠濃度主要影響篩孔的大小。實驗表明，篩孔的平均直徑和凝膠濃度的平方根成反比。 P＝kd/T1/2 P.網(wǎng)孔的平均直徑；T.多聚體濃度；d.多聚體分子直徑(5A);K.常數(shù)，假如多聚體鏈結(jié)構(gòu)近似直角交聯(lián)的，則K為1.5 例如： T＝5%時 P＝1.55A/5%1/2 ≈33.5A T＝7%時 P＝1.55A/7%1/2 ≈28.3A 交聯(lián)度C反映凝膠結(jié)構(gòu)中甲撐橋的密度。交聯(lián)過高，凝膠是不透明的，并且缺乏彈性；交聯(lián)過低，呈糜糊狀。交聯(lián)度可以決定篩孔的最大直徑。 在實驗中觀察到，要獲得透明而有合適機械強度的凝膠，單體用量高時，交聯(lián)量應(yīng)減少，單體用量低時，交聯(lián)劑量應(yīng)增大。下式是一個要求良好的電泳用凝膠的經(jīng)驗公式。 在100ml溶液中： Acr(g)Bis(g)≈常數(shù)(約1.3) 凝膠濃度與被分離物的分子量大小關(guān)系。大致可用表3表示。 表3 分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系 分 子 量 范 圍 適用的凝膠濃度(%) 蛋白質(zhì)：<104 1～4104 4104～1105 1～5105 75105 20–30 15～20 10～15 5～15 2～5 核 酸：<104 104～105 105～2106 15～20 5～10 2～2.6 最常用的凝膠，T＝7%～7.5%，C＝2%～3%，Davis標準凝膠的組成是，T＝7.2%，C＝2.6%。用此濃度的凝膠分離生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到較好的結(jié)果。當分析一個未知樣品時，常?？上扔?.2%的標準凝膠或用4%～10%的凝膠梯度來試測，而后選用適宜的膠濃度。 用于研究大分子核酸的凝膠多為大孔徑凝膠，太軟，不易操作，最好加入0.5%瓊脂糖。在3%凝膠中加入20%蔗糖，也可增加機械強度而又不影響孔徑大小。 3.聚丙烯酰胺凝膠的性能 制作良好的聚丙烯酰胺凝膠與其他凝膠相比有如下優(yōu)點： (1)聚丙烯酰胺凝膠是人工合成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，具有分子篩作用，其篩孔的大小可人為控制和調(diào)節(jié)。并且制備重復性好。 (2)聚丙烯酰胺凝膠是碳-碳結(jié)構(gòu)，沒有或很少帶有極性基因，因而吸附少，電荷作用小，不易和樣品相互作用，化學性質(zhì)比較穩(wěn)定。 (3)凝膠無色透明，適宜用光密度掃描記錄結(jié)果。且需要樣量較少。 (4)用途廣泛，具有彈性，便于操作，易于保存。 由于其具有上述特點，特別適合做區(qū)帶電泳的支持物，用于酶帶的分離以及進行分子量的測定。 三、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的機理 聚丙烯酰胺膠電泳體系有二種：連續(xù)體系與不連續(xù)體系。前者指整個電泳體系中所用的緩沖液成分、PH、凝膠網(wǎng)都相同；后者指在電泳體系中采用兩種以上的緩沖液、PH值和孔徑。按電泳裝置不同又可分為垂直管狀(圓盤)電泳和垂直平板電泳。這兩種電泳操作方式基本相同，不同的只是用于凝膠的支架或為玻璃管，或為玻璃板。這里以最常用的不連續(xù)體系的管型盤狀電泳為例，說明凝膠分離蛋白質(zhì)的機理。 圖5 盤狀電泳3種膠的組成(Davis標準狀態(tài)) (一) (一) 盤狀電泳凝膠組成 膠組成 緩沖液 T(%) C(%) 陽離子 陰離子 PH 電極緩沖液 Tris+ Cly- 8.3 樣品膠 3.1 20 Tris+ Cl- 6.7 濃縮膠 3.1 20 Tris+ Cl- 6.7 分離膠 7.2 2.6 Tris+ Cl- 8.9 電極緩沖液 圖5為聚丙烯酰胺電泳組成示意圖。電泳槽與凝膠中緩沖液的成分、PH值和離子強度均不相同。使得盤狀電泳過程中有三種物理效應(yīng)：①樣品的濃縮效應(yīng)；②凝膠的分子篩效應(yīng)；③一般電泳分離的電荷效應(yīng)。由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。下面就盤狀電泳過程中三種物理效應(yīng)的原理加以說明。 (二)樣品分離的機理 1.樣品的濃縮效應(yīng)： 由于電泳基質(zhì)的四個不連續(xù)性，使樣品在電泳開始時，得以濃縮，然后再被分離。 (1)凝膠層的不連續(xù)性：三層不同的凝膠其作用如下： a.樣品膠(sample gel)：為大孔膠，用光聚合法制備，樣品預(yù)先加在其中，起防止對流的作用，避免樣品跑到上面的緩沖液中，(目前電泳一般不制作此膠)。 b.濃縮膠(stacking gel)：為大孔膠，用光聚合法制備，有防止對流作用。樣品在其中濃縮，并按其遷移率遞減的順序逐漸在其與分離膠的界面上積聚成薄層。 c.分離膠(seperatoing gel)：為小孔膠，一般采用化學聚合法制備。樣品在其中進行電泳和分子篩分離，也有防對流作用，蛋白質(zhì)分子在大孔徑凝膠中受到的阻力小，移動速度快，進入小孔膠時遇到阻力大，速度就減慢了，由于凝膠的不連續(xù)性，在大孔與小孔凝膠的界面處就會使樣品濃縮，區(qū)帶變窄。 (2)緩沖離子成分的不連續(xù)性 在電場中如有二種電荷符號相同的離子向同一方向泳動，其遷移率不同，兩種離子若能形成界面，則走在前面的離子稱為快離子，又稱前導離子(leading ion)，走在后面的離子稱慢離子，又稱尾隨離子(trailing ion)。為了使樣品達到濃縮的目的，需在電泳緩沖系統(tǒng)中加入有效遷移率大小不同的兩種離子，并使這兩種離子在緩沖系統(tǒng)中組成不連續(xù)的兩相，即在三層凝膠中加入快離子，在電極緩沖液中加入慢離子。 為了保持溶液的電中性及一定的PH值，需加入一種與快、慢離子符號相反的離子，稱為緩沖配對離子(buffer counter ion)，使緩沖配對離子分布于全部電泳緩沖系統(tǒng)中(即三層凝膠及電極緩沖液中)。例如，分離蛋白質(zhì)樣品時，通常用氯根(Cl-)為快離子，甘氨酸根負離子(NH2CH2COO-)為慢離子，三羥甲基氨基甲烷(Tris+)作為緩沖配對離子。 圖6 聚丙烯酰胺凝膠電泳原理示意圖 (a)電泳開始時；(b)樣品進入濃縮膠被濃縮成一薄層；(c)樣品進入分離膠被分離。 電泳開始前(圖6A) 慢離子位于兩個電極槽中，快離子分布在三層凝膠中，樣品在樣品膠中，緩沖配對離子位于全部系統(tǒng)中。 電泳進行中(圖 6B) 快離子與慢離子的界面向下移動。 由于選擇適當?shù)腜H值緩沖液，使蛋白質(zhì)樣品的有效遷移率介于快、慢離子的界面處，而濃縮成為極窄的區(qū)帶。它們的有效遷移率，按下列次序排列，mclαcl＞ m pαp＞ m GαG。樣品若是有顏色的，可以看到樣品在界面處堆積濃縮成極窄的區(qū)帶。 樣品分離(圖6C) 當樣品達到濃凝膠與分離界面處，離子界面繼續(xù)前進，蛋白質(zhì)被留在后面，然后分成多個區(qū)帶。 (3)電位梯度的不連續(xù)性 電位梯度的高低與電泳速度的快慢有關(guān)，因為電泳速度等于電位梯度與遷移率的乘積，遷移率低的離子，在高電位梯度中可以與具有高遷移率而處于低電位梯度的離子具有相似的速度。 vi＝miαiE 要v一樣 mα低的，E要高 在不連續(xù)系統(tǒng)中，電位梯度的差異是自動形成的。 電泳開始后，由于快離子的遷移率最大，就會很快超過蛋白質(zhì)，因此在快離子的后邊形成一個離子濃度低的區(qū)域即低電導區(qū)。電導與電位梯度是成反比的。 V＝IR＝I ∵L＝1/R ∴E＝V/l＝I/Ll V.電壓；I.電流；R.電阻；L.電導；E.電位梯度V/l 因在串聯(lián)電路中，電流處處相等，因此，I＝ELl， 在低電導區(qū)就有較高的電位梯度。 高電位梯度 低電位梯度 電極緩沖液樣品膠 濃縮膠 分離膠 快離子 慢離子 蛋白質(zhì) 圖7 不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應(yīng)示意圖 這種高電位梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動。當快離子、慢離子和蛋白質(zhì)有效遷移率和電位梯度的乘積彼此相等時，(mαE)快＝(mαE)p＝(mαE)慢＝v，則三種離子移動速度相同，在快離子和慢離子的移動速度相等的穩(wěn)定狀態(tài)建立之后，則快離子和慢離子之間形成一個穩(wěn)定而又不斷向陽板移動的界面。也就是說在高電位梯度區(qū)和低電位梯度區(qū)之間的地方形成一個迅速移動的界面(圖7)，由于蛋白質(zhì)樣品的有效遷移率恰好介于快慢離子之間，因此也就聚焦在這個移動的界面附近，被濃縮形成一個狹小的中間層。 (4)PH的不連續(xù)性 在濃縮膠與分離膠之間有PH的不連續(xù)性，這是為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率，要求在樣品膠和濃縮膠中，慢離子較所有被分離樣品的有效遷移率低，以使樣品夾在快、慢離子界面之間，使樣品濃縮。而在分離膠中慢離子的有效遷移率比所有樣品的有效遷移率高，使樣品不再受離子界面的影響。 (1)濃縮膠應(yīng)有的PH值 在PH8.0以上時，血清中的蛋白質(zhì)遷移率在-0.6～-7.5遷移率單位之間，要求甘氨酸的有效遷移率小于-0.6單位。設(shè)為-0.5單位，即m GαG＝-0.5，已知 m G＝-15 αG ＝ -0.5/-15 ＝ 1/30 又 PH＝PKa+1ga/(1-a) 已知，甘氨酸PKa＝9.8 與α值一起代入上式，計算出PH為8.3， (2)分離膠應(yīng)有的PH值 在分離膠中要求甘氨酸有效遷移率(m GαG)超過所有蛋白質(zhì)的有效遷移率，這樣甘氨酸的泳動速度即超過所有的蛋白質(zhì)，使分離膠保持均一的PH及電位梯度，以使蛋白質(zhì)樣品在其中進行普通的電泳分離和分子篩分離。 血清中的前清蛋白在7.5%凝膠中遷移率小于-5.0單位，則m GαG至少應(yīng)為-5.0，即α＝1/3 (∵mG＝-15 α＝-5/-15 ＝ 1/3 )，按 PH＝PKa+1g a/(1-a) 計算, PH應(yīng)為9.5。 實際上Davis所用的配方中，分離膠的PH值為8.9，但在電泳分離時，根據(jù)實際測定證明與理論計算相符，實際上比原制備時的PH約高出半個PH單位，所以與要求的數(shù)值是符合的。 2.分子篩效應(yīng) 分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同，因此表現(xiàn)出不同的遷移率，即所謂分子篩效應(yīng)，即使凈電荷相似，也就是說自由遷移率相等的蛋白質(zhì)分子，也會由于分子篩效應(yīng)在分離膠中被分開。 此處分子篩效應(yīng)是指樣品通過一定孔徑的凝膠時，小分子走在前面，大分子走在后面與凝膠層析的分子篩效應(yīng)相反。 3.電荷效應(yīng) 蛋白質(zhì)混合物在膠界面處被高度濃縮，堆積成層，形成一狹小的高濃度的蛋白質(zhì)區(qū)，但由于每種蛋白質(zhì)分子所載有效電荷不同，因而遷移率不同。承載有效電荷多的，泳動得快，反之則慢，因此各種蛋白質(zhì)就以一定的順序排列成一個一個的圓盤狀。在進入分離膠時，此種電荷效應(yīng)仍起主要作用。 綜上所述，樣品的濃縮效應(yīng)是在濃縮膠中進行的，電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)主要是在分離膠中進行的。在蛋白質(zhì)樣品進入分離膠時，由于在濃縮膠中的慢離子跑到蛋白質(zhì)前面去，高電勢梯度消失，使蛋白質(zhì)進入到均一電勢梯度和PH的分離膠中。此時，又由于分離膠的孔徑小，各蛋白質(zhì)因分子大小和形狀不一樣而被這孔徑阻滯的程度也不相同，使一些即使是凈電荷相同的蛋白質(zhì)分子也因分子篩效應(yīng)不同而得到分離。 四、聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作方法 (一)管型盤狀電泳 1.儀器和設(shè)備 圖8 管型盤狀電泳槽結(jié)構(gòu) A為正面 B為剖面 (1)分離膠PH8.9 (2)濃縮膠PH6.7 (3)電極緩沖液PH8.3 圖9 在玻璃管中裝有3層不同的凝膠示意圖 電泳槽：盤狀電泳槽國內(nèi)有很多單位生產(chǎn)，也可因地制宜，自己制造，槽大多為圓筒形(圖9)，也有長方形的，上、下槽分別接鉑金絲電極，要注意電極到各膠管的距離相等，以保持各凝膠管的電場一致。 電泳儀：國內(nèi)生產(chǎn)的型號很多，如北京六一儀器廠的DYY-Ⅲ型，電壓在0～600v內(nèi)任意調(diào)節(jié)，電流輸出0～100mA，這類電泳儀比較恰當。 玻璃管：選擇粗細均一的圓玻璃管，內(nèi)徑5～7mm左右，管長70～100mm。管口用金剛砂磨平，電泳管的清潔很重要，需浸入10%重鉻酸鹽-硫酸溶液中清洗，再用蒸餾水徹底淋洗干凈，在管中滴入丙酮而后干燥備用。 聚膠架：普通試管架式樣，有機玻璃制成，架的孔洞內(nèi)裝一乳膠管，要求乳膠管孔內(nèi)徑與玻璃管外徑相同或略小。 微量注射器或微量進樣器：加樣時，由于需樣品量極小，作定量分析時要求樣品量準確，因此最好用25.50或100μl的微量進樣器加樣，也可用50或100μl加液器代用。 普通注射器：主要用于灌膠和剝膠，20～30ml，附加10號不銹鋼長針頭(約10cm長)。 其他：日光臺燈，PH計，恒溫水浴，燒杯，容量瓶，量筒，試管，漏斗，濾紙，電爐，電子天平等。 2.試劑 甲叉雙丙烯酰胺(Bis)；丙烯酰胺(Acr)；四甲基乙二胺(TEMED)；過硫酸銨；核黃素(VB2)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)；蔗糖；甘氨酸；鹽酸等。 丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺產(chǎn)品不純時需要純化后才能使用。 (1)丙烯酰胺純化法：70g丙烯酰胺溶于500ml氯仿中(50℃)，熱濾，濾液涼后置-20℃冰箱，即有結(jié)晶析出，砂芯漏斗過濾，收集結(jié)晶。結(jié)晶置于真空干燥器中減壓干燥，貯棕色瓶中備用。 (2)甲叉雙丙烯酰胺純化法：12g甲叉雙丙烯酰胺溶于100ml 40～50℃丙酮，加熱過濾，濾液置-20℃冰箱，結(jié)晶析出后過濾，并置于真空干燥器中干燥，保存于棕色瓶中備用。 3.試劑配制 (1)凝膠及緩沖液配制系統(tǒng) 有關(guān)資料很多，可以根據(jù)需要選擇適宜的系統(tǒng)。列表4供參考。最常用的是系統(tǒng)1(所謂Davis的標準狀態(tài))。各種貯存液配制后，盛于棕色瓶中，貯冰箱備用。用時需測PH值，以檢查是否失效。TEMED要密封貯藏。過硫酸銨溶液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，不宜超過一周。 表4 幾種適用電泳的聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng) 系統(tǒng)Ⅰ (PH值8.9)(7.2%) 系統(tǒng)Ⅱ (PH值7.5)(7.5%) 系統(tǒng)Ⅲ (PH值4.3)(15%) 系統(tǒng)Ⅳ (PH值2.9)(7.5%) 溶液號 組份/100 ml PH 值 溶液號 組份/100ml PH值 溶液號 組份/100ml PH值 溶液號 組份/100ml PH值 1 1mol/l HCl 48.0ml Tris 36.3克 TEMED 0.46ml 8.9 15 1mo;/L HCl 48.0ml Tris 6.85克 TEMED 0.46ml 7.5 17 1mol/L KOH 48.0ml 醋酸17.2 mlTEMED 4.0ml 4.3 20 1mol/l KOH 12.0ml 醋酸.25ml TEMED 1.15ml 2.9 2a 丙烯酰胺 28.0克 雙丙烯酰胺0.735克 8 2 丙烯酰胺 30.0克 雙丙烯酰胺0.8克 6 8 丙烯酰胺 60.0克 雙丙烯酰胺0.4克 21 過硫酸銨 2.8克 3 過硫酸銨 0.14克 16 1N H3PO4 39.0ml Tris 4.95克TEMED 0.46ml 5.5 18 過硫酸銨 0.28克 22 1N KOH 48.0升 醋酸2.95ml 5.9 4a 1N HCl 48ml Tris 5.98克 TEMED 0.46ml 6.7 19 1N KOH 48.0ml 醋酸2.87ml TEMED 0.46ml 6.7 5 丙烯酰胺 10.0克 雙丙烯酰胺2.5克 6.7 6 核黃素 4.0mg 7 蔗糖 40.0克 電極緩沖液： Tris 6.0克 甘氨酸 28.8克 加水至 1升 使用：10%稀釋液 8.3 電極緩沖液： 二乙基巴比妥 5.82克 Tris 1.0克 加水至 1升 7.0 電極緩沖液： β-丙氨酸 32.2克 醋酸 8.0克 加水至1升 使用：10%稀釋液 4.5 電極緩沖液： 甘氨酸 28.1克 醋酸 3.06ml 加水至1升 使用：10%稀釋液 4.0 電極：上槽接負極Θ 下槽接正極⊕ 電極：上槽接負極Θ 下槽接正極⊕ 電極：上槽接正極⊕ 下槽接負極Θ 電極：上槽接正極⊕ 下槽接負極Θ 各溶液混合比 各溶液混合比 各溶液混合比 各溶液混合比 濃縮膠 分離膠 濃縮膠 分離膠 濃縮膠 分離膠 濃縮膠 分離膠 1份4a號 2份5號 1份6號 4份7號 1份1號 2份2a號 1份水 4份3號 1份16號2份5號 1份6號 4份7號 1份15號 2份2號 1份水 4份3號 1份19號 2份5號 1份6號 4份7號 1份17號 2份8號 1份水 4份18號 1份22號 2份5號 1份6號 4份7號 4份20號 2份2號 2份21號 (2)指示劑配制 蛋白質(zhì)樣品通常是無色的，為了觀察和估計樣品在凝膠上遷移情況，常加指示劑作為電泳遷移的可見標志。對堿性緩沖系統(tǒng)，一般用溴酚藍或酚紅，對于酸性緩沖系統(tǒng)，一般用甲基綠或次甲基蘭。指示劑可直接加在樣品中，也可加在電泳槽的緩沖液中，也可加在玻管中。 溴酚藍通常配制成0.1%的母液備用。 (3)染色劑配制 蛋白質(zhì)的染色方法很多，常用的染色劑有氨基黑10B，考馬斯亮藍R250，考馬斯亮藍G250等，有關(guān)配制濃度，染色方法以及同工酶的顯色方法見操作過程中的染色部分。 4.操作技術(shù) (1)凝膠制備 配制凝膠前，應(yīng)把玻璃管裝好。裝玻管的方式很多：在凝膠架的孔洞內(nèi)，加少許40%蔗糖溶液，然后把洗凈干燥的玻璃管套上乳膠管，插入架的孔洞內(nèi)，使玻璃管、乳膠管與孔底相平；玻璃管的一端用青霉素瓶蓋封口，或者用附有玻璃短柱的乳膠管封口；底平坦的玻管也可用橡皮膏布封口，封口的玻管安放在試管架上；也可把玻璃管用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培養(yǎng)皿中，然后用1%瓊脂趁熱倒在培養(yǎng)皿中，冷卻后，玻璃管口即被瓊脂凝膠封住。 配制凝膠時，先將所需的貯備液自冰箱中取出，放至室溫下預(yù)溫。 聚丙烯酰胺凝膠通常只制備二種膠。先制備分離膠，再在分離膠上面制備濃縮膠，樣品膠一般不制作，這是因為①有些樣品會抑制膠聚合；②光照可引起某些蛋白質(zhì)變性；③多了一道手續(xù)，延長制膠時間。 分離膠的制備：按表4比例混合貯存液，(先不與過硫酸銨混合)，放在真空干燥器中抽氣，排除溶液中空氣。抽氣后在貯存液中加入過硫酸銨混勻，用注射器沿玻璃管壁慢慢注入膠液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好標記，注膠到相同的高度。務(wù)必勿使氣泡出現(xiàn)。為了使凝膠表面平整，在凝膠表面再慢慢地加入一層水，約3～5mm高度，消除凝膠的彎月面。加水要小心，切勿沖亂界面。加水的另一作用是隔絕空氣中氧與膠液接觸。以防影響頂部膠層的聚合。注射器中殘留的膠液要立即清洗掉，以防膠液在針頭與注射器中聚合，而使其損壞。 水層放好后，靜置30分鐘，使凝膠進行化學聚合反應(yīng)。聚合最適溫度為25℃。當水剛加入膠面時，水與凝膠形成一界面，后界面慢慢消失，當凝膠聚合時，水與凝膠之間又出現(xiàn)界面。界面的再出現(xiàn)表明凝膠已經(jīng)聚合，再靜置20～30分鐘，聚合便完全。 分離膠的預(yù)電泳(此步驟應(yīng)根據(jù)實驗的需要決定取舍)：凝膠聚合程度一般在90%以上。殘留的物質(zhì)，尤其是過硫酸銨，對某些樣品(如酶)會造成鈍化或引起其它人為效應(yīng)。因此有時需要在正式電泳前，先用電泳方法除去這些殘留物，稱為“預(yù)電泳”。若直接用光密度計來掃描分離的區(qū)帶，則預(yù)電泳更為重要，因未聚合的丙烯酰胺單體對紫外光有較高吸收，會干擾測定。步驟：去除玻管封口，倒出玻管中凝膠上的水分，并用分離膠緩沖液洗滌一下。把玻管插入電泳裝置中。上下電極槽中均加入分離膠緩沖液，預(yù)電泳的電流為3mA/管，時間需30分鐘～2小時。預(yù)電泳不能在制好濃縮膠后進行，也不能用電極緩沖液進行，不然會破壞不連續(xù)系統(tǒng)，而使?jié)饪s效應(yīng)失效。 濃縮膠的制備：分離膠聚合好后，或已經(jīng)過預(yù)電泳的分離膠，用注射器小心吸去水層，用濾紙條吸去殘余的水。按表4中比例混合濃縮膠液(也預(yù)先抽氣，抽氣時不要與核黃素混合，使用時再混勻)，先用這種凝膠液漂洗一下分離膠頂，除去漂洗液后，再用注射器加濃縮膠溶液1cm左右，各管加的高度應(yīng)一致，并在上面加水層壓平膠面。放在兩只20W以上功率的日光燈下，約離燈管10～15cm處，光下聚合60分鐘左右，當濃縮膠由淺黃色變?yōu)椴煌该鞯娜榘咨?，即聚合完成，取出水層，吸干后用電極緩沖液洗滌，準備加樣。濃縮膠應(yīng)臨用前制備。 (2)樣品的準備 聚丙烯酰胺盤狀電泳可用于分離各種蛋白質(zhì)、核酸等樣品。例如血清、唾液、細胞膜蛋白，動植物及微生物的各種蛋白提取液，昆蟲的體液，各種酶制品，色素蛋白復合體以及核糖核酸等。初學者可用現(xiàn)成的蛋白質(zhì)樣品如血清練習操作。 盤狀電泳所需要的樣品是很少的。一個標準凝膠管按體積，需要5～100μl的樣品(約0.1～2mm高)；按含量需要5～100μg。實際上就是用0.1%濃度的樣品5～100μl。由于樣品組分的不同，用量可有一定的幅度。對于只含有少數(shù)組分的樣品，通常用10～20μg，對于含有多種組分的樣品，可用到200μg。即每一凝膠的樣品容納量不僅指所加的樣品總量，更重要的是指樣品混合物組分的量。所加樣品液量的精確性將影響重復性，誤差要不大于5%。 近來，樣品膠一般已改用樣品液中加入5%～20%的蔗糖或10%甘油代替，因為樣品膠的作用主要是抗對流，蔗糖液和甘油能起同樣的效果。 如果樣品離子強度太高，會引起分界面模糊不清，嚴重時完全不能進行電泳。因離子強度太高時降低了蛋白質(zhì)的電動電位，同時電導過高，在樣品部分幾乎沒有電勢梯度，以至樣品的泳動速度近于零，不能泳動。硫酸銨鹽析的樣品或柱層析高鹽濃度的洗脫部分，必須透析除鹽，務(wù)必使其電導低于分離膠的電導，以便形成足夠的電勢梯度，使區(qū)帶在分離之前進行濃縮變窄。 如果樣品過稀，加樣體積太大時，相應(yīng)地加厚濃縮膠層。玻璃管也要適當加長。通常稀樣液與濃縮膠的比不大于1∶1.2。 一個生物樣品(粗抽提物)，常需要事先經(jīng)過處理(高速離心，微孔濾膜過濾，柱分離等)去除沉淀，消除混濁?；蛑蝗】扇苄圆糠诌M行電泳。不然常有許多物質(zhì)留在凝膠與緩沖液的界面上，阻塞凝膠，干擾分離。當樣品裝載量與樣品溶解度不相應(yīng)時，也會在濃縮膠上或濃縮膠與分離膠界面上產(chǎn)生沉淀，并造成拖尾現(xiàn)象(隨著電泳過程，沉淀逐漸溶解，逐漸進入)。 加樣前先把密封下口的物件除去，如果是拔橡皮帽，應(yīng)先讓空氣進去，再拔管子，防止凝膠拉壞。下槽中放滿緩沖液，把玻管固定在盤狀電泳槽上槽的洞中。安裝時要特別注意保證凝膠管垂直和橡膠塞孔密封不漏。管的下端懸一滴電極緩沖液。先在下槽放上電極緩沖液，再把上槽放在下槽上，避免管下有氣泡。然后加樣。 加樣方法因人習慣不同而略有差異。有的把樣品與增加比重的蔗糖及指示劑先混在一起加樣；有的指示劑單獨加在玻璃管中或在上槽電極緩沖液中滴上幾滴指示劑。加樣時，有的先加好樣液，再在樣品上加幾滴緩沖液，然后在樣液上加電極槽緩沖液；有的先在上槽中加滿電極緩沖液，然后用加樣器插在緩沖液中往膠管濃縮膠上方加樣?？偟脑瓌t，先提高樣品的比重，后加樣，加樣和加電極緩沖液互不干擾。 (3)電泳 在電泳槽中注滿電極緩沖液。緩沖液應(yīng)事先在冰箱中預(yù)冷，上槽電極緩沖液必須浸沒玻管和電極。連接直流穩(wěn)壓電源，緩沖液系統(tǒng)為堿性時上槽為負極，下槽為正極。緩沖系統(tǒng)為酸性時則相反。Davis標準狀態(tài)的凝膠電泳，負極在上，正極在下，電泳槽一般放在冰箱中，保持溫度在0～4℃。打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流，開始時用1～2mA/管，電泳3～5分鐘后，再逐漸升高到4mA/管。不要一開始就電流很高。電流最好不要超過5mA/管。太高的電流強度會造成產(chǎn)熱量大，使分離失敗。如果高溫對樣品不利，可降低電流，延長時間，或進行有效冷卻，在整個電泳過程中，一般要求電流保持穩(wěn)定。電泳時間與所用緩沖液和樣品有關(guān)，一般根據(jù)指示劑的遷移來決定，如果指示劑已遷移到凝膠柱的下口附近，或已遷移管長的3/4距離時，就可停止電泳，關(guān)閉電源，取出玻璃管。 上槽電極緩沖液可連續(xù)使用幾次，但必須每次測一下PH，如PH值發(fā)生改變就不能再使用。每次電泳后，下槽中混入了催化劑及氯離子，如將下槽緩沖液用于上槽，則影響電泳。重要的電泳，電極緩沖液最好用新鮮的。 (4)剝膠 為了防止電泳后凝膠中蛋白(酶)盤狀區(qū)帶擴散，電泳完畢必須立刻取出凝膠柱進行固定與染色，一般用20～30ml的注射器配上10cm長的針頭，左手拿玻管，右手握灌滿水的注射器，將針頭插入凝膠與管壁之間，左手慢慢旋轉(zhuǎn)玻管，右手一邊壓水，一邊使針頭呈螺旋式推進?？克鲏毫蜐櫥⒉ＡЧ軆?nèi)壁與凝膠分開，一般情況下，針頭抽出，膠就自動滑出。如果不出，就從另一端再注水或用洗耳球在一端稍加壓力。如果膠濃度較高，取出困難，可用10%甘油水溶液代替水注入。一般剝膠的方向是從濃縮膠端開始。剝膠時應(yīng)注意不要損傷膠柱表面。 (5)固定與染色 為防止凝膠柱內(nèi)已分離成分的擴散，需要進行固定。剝出的凝膠柱只要浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中幾分鐘就可達到蛋白帶固定的效果。也可浸泡在用7%乙酸或12.5%三氯乙酸配制的染色液中，同時進行固定和染色。如果用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和鑒定同工酶，為了讓酶帶上進行某種顯色反應(yīng)，往往是先顯色后固定。 三氯醋酸固定蛋白質(zhì)的機制可能是這樣：其分子不僅與蛋白質(zhì)帶正電荷側(cè)鏈結(jié)合，而且通過氫鍵與蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)合，其結(jié)果使蛋白質(zhì)分子失去水分子，同時在肽鏈表面包上一層疏水的CCl3基團，使蛋白質(zhì)水溶性破壞，從水相沉淀在凝膠相上。乙酸固定蛋白質(zhì)的機制可能同三氯乙酸一樣。 電泳后蛋白質(zhì)區(qū)帶的檢測，對于不同的目的，應(yīng)采用不同的檢測方法，最常用的方法是用染料和生物大分子結(jié)合形成有色的復合物，選用染料通常應(yīng)考慮以下要求：A)必須與大分子結(jié)合以形成一個不溶性的，有色的，緊密的復合物，但不結(jié)合到凝膠中和支持膜上，以便從凝膠中除去，否則背景會影響蛋白帶的辨別和定量掃描;B)染料必須容易溶解在對大分子沒有影響的溶劑中，以利于背景的脫色;C)選用高吸光系數(shù)的染料有利于提高定量測定的靈敏度;D)選用能與大分子有專一性結(jié)合的染料，并在結(jié)合后能產(chǎn)生不同的顏色，可以提高檢測的選擇性。 用于蛋白質(zhì)區(qū)帶染色的試劑常用的有氨基黑10B、考馬斯亮藍，1-苯胺基-8-萘磺酸等，其性能及染色原理如下： ①氨基黑10B (amino black 10B) C22H13O12N6S3Na3 MW＝715 λmax＝620～630nm 氨基黑是酸性染料，其磺酸基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復合鹽。是最常用的蛋白質(zhì)染料。但用氨基黑染SDS-蛋白質(zhì)時效果不好。另外氨基黑染不同蛋白質(zhì)時的著色度不等，色調(diào)不一(有藍、黑、棕等)，作同一凝膠柱的掃描時誤差較大，需要對各種蛋白質(zhì)作出本身的蛋白質(zhì)-染料量(吸收值)的標準曲線。 ②考馬斯亮蘭R250(Coomassie brilliant blne R250) 即三苯基甲烷(triphenylmethane) C46H44O7H3S2Na MW＝824 λmax＝560～590nm 染色的靈敏度比氨基黑高5倍。尤其適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色，但蛋白質(zhì)濃度超出一定范圍時，對高濃度蛋白的染色不合乎Beer定律，用作定量分析時要注意這點。 ③考馬斯亮蘭G250(Coomassie brilliant blne G250)，即二甲花青亮藍(Xylene Cyanine brilliant Blue)，MW＝854，λmax＝590～610nm，染色靈敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。優(yōu)點在于它在三氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地染色蛋白而幾乎無本底色。所以常用于需要重復性好和穩(wěn)定的染色，適于作定量分析。 氨基黑與考馬斯亮蘭兩種染料的共同點是：都帶有負電荷的磺酸基，能與蛋白分子上帶正電荷的側(cè)鏈相結(jié)合。但是，氨基黑分子含有較多的親水基團，和蛋白質(zhì)親水微區(qū)以及親水的凝膠基質(zhì)有很大的親和力。而考馬斯亮蘭卻相反，含有較多的疏水基團，和蛋白質(zhì)的疏水區(qū)有較大的親和力，而和凝膠基質(zhì)的親和力不如氨基黑。因此，用考馬斯亮蘭染色的漂洗要容易得多。另外，考馬斯亮蘭的靈敏度要比氨基黑高。 4.1-苯胺基-8-萘磺酸(1-animo-naphthal sulfonic acid簡稱ANS)，MW＝241，本身無熒光，但與蛋白質(zhì)結(jié)合后則產(chǎn)生熒光。電泳后，凝膠在此染料溶液浸1～3分鐘，用長波紫外燈照射時產(chǎn)生黃色熒光，可顯示蛋白質(zhì)100mg，如果不明顯，可將凝膠取出暴露于空氣或鹽酸氣中，或浸沒在3mol/L鹽酸中幾秒至2分鐘，使表面蛋白質(zhì)稍變性,然后再用 表5 蛋白質(zhì)的常染色法 方 法 固 定 液 染 料 染色時間 脫 色 氨基黑 10B 甲 醇 7%乙酸 0.1N氫氧化鈉中1%氨基黑 7%乙酸中0.5%～1%氨基黑 5分鐘(室溫) 2小時(室溫) 10分鐘(96℃) 5%乙醇 7%乙酸 考馬斯亮蘭 R250 20%磺基水楊酸 10%三氯乙酸 樣品中含尿素的在5%三氯乙酸中固定 0.25%R250水溶液 10%三氯乙酸-1%R250 19∶1(V/V) 5%磺基水楊酸和1%R250 19∶1 5分鐘(室溫) 0.5小