凝膠電泳緩沖液及配制.doc
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2.測序凝膠加樣緩沖液 98%去離子甲酰胺 10mol/L EDTA(pH8.0) 0.025%二甲苯青FF 0.025%溴酚藍 甲酰胺:許多批號的試劑級甲酰胺,其純度符合使用要求,無須再進行處理。不過,一旦略呈黃色,則應用在磁力攪拌器上將甲酰胺與Dowex XG8混合床樹脂共同攪拌1小時進行去離子處理,并用Whatman 1號濾紙過濾2次,去離子甲酰胺分裝成小份,充氮存于-70℃。 3.常用的電泳緩沖液 緩沖液 使用液 濃貯存液(每升) Tris-乙酸(TAE) 1:0.04mol/L Tris-乙酸 50:242g Tris堿 0.001mol/L EDTA 57.1ml冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-磷酸(TPE) 1:0.09mol/L Tris-磷酸 10:10g Tris堿 0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸(1.679g/ml) 40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸(TBE)a 0.50.045mol/L Tris-硼酸 5:54g Tris堿 0.001mol/L EDTA 27.5硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 堿性緩沖液b 1:50mmol/L NaOH 1:5ml 10mol/L NaOH 1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) Tris-甘氨酸c 1:25mmol/L Tris 5:15.1g Tris 250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸(電泳級)(pH8.3) 0.1% SDS 50ml 10% SDS(電泳級) 說明: ?、賂BE溶液長時間存放后會形成沉淀物,為避免這一問題,可在室溫下用玻璃瓶保存5溶液,出現沉淀后則予以廢棄。 以片都以1TBE作為使用液(即1:5稀釋濃貯液)進行瓊脂糖凝膠電泳。但0.5的使用液已具備足夠的緩沖容量。目前幾乎所有的瓊脂糖膠電泳都以1:10稀釋的貯存液作為使用液。 進行聚丙烯酰胺凝膠垂直槽的緩沖液槽較小, 故通過緩沖液的電流量通常較大,需要使用1TBE以提供足夠的緩沖容量。 ?、趬A性電泳緩沖液應現用現配。 ?、跿ris-甘氨酸緩沖液用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。 4.2SDS凝膠加樣緩沖液 100mmol/L TrisHCl(6.8) 200mmol/L二硫蘇糖醇(DTT) 4%SDS(電泳級) 0.2%溴酚藍 20%甘油 不含DTT的2SDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫,應在臨用前取1mol/L貯存液現加于上述緩沖液中。 5.凝膠加樣緩沖液 緩沖液類型 6緩沖液 貯存溫度 Ⅰ 0.25%溴酚藍 4℃ 0.25%二甲苯青FF 40%(W/V)蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25溴酚藍 室溫 0.25%二甲苯青FF 15%聚蔗糖(Ficoll400) Ⅲ 0.25%溴酚藍 4℃ 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液 Ⅳ 0.25%溴酚藍 4℃ 40%(W/V)蔗糖水溶液 堿性加樣緩沖液: 300mmol/L NaOH 6mmol/L EDTA Ⅴ 18%聚蔗糖(Ficoll400) 4℃ 0.15%溴甲酚綠 0.25%二甲苯青FF 使用以上凝膠加樣緩沖液的目的有三:增大樣品密度;以確保DNA均勻進入樣品孔內;使樣品呈現顏色,從而使加樣操作更為便利,含有在電塊中能以可預知速率向陽極泳動的染料。溴酚藍在瓊脂糖中移動的速率約為二甲苯青FF的2.2倍,而與瓊脂糖濃度無關。以0.5TBF作電泳液時,溴酚藍在瓊脂糖中的泳動速率約與長300bp的雙鏈線狀DNA相同,而二甲苯青FF的泳動則與長4kb的雙鏈線狀DNA相同。在瓊脂糖濃度為0.5%~1.4%的范圍內,這些對應關系受凝膠濃度變化的影響并不顯著。 選用哪一種加樣染料純屬個人喜惡。但是,對于堿性凝膠應當使用溴甲酚綠作為示蹤染料,因為在堿性pH條件下其顯色較溴酚更藍為鮮明。- 配套講稿:
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