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歡迎進入生物課堂 基因工程的基本操作程序 專題 基因工程 補 原核細胞的基因結(jié)構(gòu) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚酶結(jié)合位點 啟動子 終止子 RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結(jié)合位點 并與其結(jié)合 轉(zhuǎn)錄開始后 RNA聚合酶沿DNA分子移動 并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA 轉(zhuǎn)錄完畢后 RNA鏈釋放出來 緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來 不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA 不能編碼蛋白質(zhì) 能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA 能編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 原核細胞的基因結(jié)構(gòu) 有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列 在該序列中 最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點 啟動子 補 真核細胞的基因結(jié)構(gòu) 編碼區(qū) 與RNA聚酶結(jié)合位點 內(nèi)含子 外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子 內(nèi)含子能轉(zhuǎn)錄為信使RNA 啟動子 終止子 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 內(nèi)含子 外顯子 真核細胞的基因結(jié)構(gòu) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 外顯子 能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子 不能編碼蛋白質(zhì)的序列 有調(diào)控作用的核苷酸序列 包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點 非編碼序列 包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子 原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較 思考 編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì) 原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎 連續(xù) 不連續(xù) 編碼區(qū) 非編碼 不一樣 真核細胞基因結(jié)構(gòu)要長一些 基因工程的基本操作程序主要包括四個基本步驟 1 目的基因的獲取2 基因表達載體的構(gòu)建3 將目的基因?qū)胧荏w細胞4 目的基因的檢測與鑒定 步驟一 目的基因的獲取 目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因 獲取目的基因是實施基因工程的第一步 如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因 還有植物的抗病 抗病毒 抗細菌 基因 種子貯藏蛋白的基因 以及人的胰島素基因 干擾素基因等 目的基因的提取方法 直接分離基因人工合成基因 反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA 鳥槍法 從基因文庫中獲取目的基因 基因文庫 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段 導入受體菌的群體中儲存 各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因 稱為基因文庫 genelibrary 基因組文庫 基因文庫中包含了一種生物所有的基因 這種基因文庫叫做基因組文庫 部分基因文庫 基因文庫中包含了一種生物的一部分基因 這種基因文庫叫做部分基因文庫 用DNA重組技術(shù)將某種生物的總DNA用特定的限制性內(nèi)切酶切割成一個個片段 然后將這些片段隨機地連接在某些質(zhì)粒或其他載體上 再將它們轉(zhuǎn)移到適當?shù)乃拗骷毎?通過細胞的增殖而構(gòu)成各個片段的無性繁殖系 克隆 這些無性繁殖系總體就叫這種生物的基因文庫 當類似這樣的克隆多到可以包括某種生物的全部基因時 這一批克隆的總體就稱為該種生物的基因組文庫 這一定義也適用于線粒體DNA和葉綠體DNA 分別稱為某種生物的線粒體基因組文庫或葉綠體基因組文庫 為了有效地保存基因文庫 可通過細菌在固體培養(yǎng)基上繁殖而使包含各個特定DNA片段的細菌增多 通過分子雜交的方法 可以篩選出包含有所需基因的DNA片段的細菌 經(jīng)過擴增得到大量這樣的細菌 從中便可分離出所需基因的DNA片段 建立和使用基因文庫是分離高等真核生物基因的有效手段 對于基因定位和基因工程的研究都很有用 1 鳥槍法 散彈射擊法 用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段 將這些片段分別載入運載體 然后通過運載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細胞 讓供體細胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個受體細胞中大量復(fù)制 即擴增 從中找出含有目的基因的細胞 再利用一定發(fā)方法將目的基因的DNA片段分離出來 1 反轉(zhuǎn)錄法 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板 反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA 然后在酶的作用下合成雙鏈DNA 從而獲得所需的基因 目的基因的mRNA 雙鏈DNA 即目的基因 反轉(zhuǎn)錄 合成 2 人工合成基因法 2 根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列 推測出相應(yīng)的信使RNA序列 然后按照堿基互補配對原則 推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 再通過化學方法 以單核苷酸為原料合成目的基因 蛋白質(zhì)的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 推測 推測 目的基因 化學合成 上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點 操作簡便廣泛使用 工作量大 盲目 分離出來的有時并非一個基因 專一性強 操作過程麻煩 mRNA很不穩(wěn)定 要求的技術(shù)條件較高 專一性最強 僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因 哪些新技術(shù)能大大簡化基因工程的操作技術(shù) 1 DNA序列自動測序儀 2 PCR技術(shù) 對提取出來的基因進行核苷酸序列分析 使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增 目的基因的獲得 從基因文庫獲得基因文庫利用PCR技術(shù)擴增人工合成 基因組文庫部分基因文庫 已知序列 未知序列 步驟二 基因表達載體的構(gòu)建 1 用一定的限制酶切割質(zhì)粒 使其出現(xiàn)一個切口 露出黏性末端 2 用同一種限制酶切斷目的基因 使其產(chǎn)生相同的黏性末端 3 將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處 再加入適量DNA連接酶 形成了一個重組DNA分子 重組質(zhì)粒 目的基因與運載體的結(jié)合過程 實際上是不同來源的基因重組的過程 常用的受體細胞 有大腸桿菌 枯草桿菌 土壤農(nóng)桿菌 酵母菌和動植物細胞等 將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理 借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑 步驟三 目的基因?qū)胧荏w細胞 1 將目的基因?qū)胫参锛毎?2 將目的基因?qū)雱游锛毎?1 將細菌用CaCl2處理 以增大細菌細胞壁的通透性 2 使含有目的基因的重組質(zhì)粒進入受體細胞 3 目的基因在受體細胞內(nèi) 隨其繁殖而復(fù)制 由于細菌繁殖的速度非常快 在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因 3 將目的基因?qū)胛⑸锛毎?大腸桿菌細胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是 步驟四 目的基因的檢測與鑒定 前三步的處理十分繁鎖 為保證目的基因得到有效利用 通常用大量的受體細胞來接受不多的目的基因 這樣 處理的受體細胞中真正攝入了目的基因的很少 必須將它從中檢測出來 細菌的檢測 將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落 檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物 淘汰無表達產(chǎn)物的菌落 保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng) 研究 思考 檢測mRNA是否合成 可以用分子雜交的方法嗎 檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 抗原 抗體雜交 個體生物學水平的鑒定 不能 受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀 才能說明目的基因完成了表達 受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎 若不能表達 要對抗蟲基因再進行修飾 1 以下說法正確的是 A 所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B 質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體C 運載體必須具備的條件之一是 具有多個限制酶切點 以便與外源基因連接D 基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來 C 練習 2 不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是A 能復(fù)制 B 有多個限制酶切點C 具有標記基因D 它是環(huán)狀DNA D 練習 3 有關(guān)基因工程的敘述中 錯誤的是 A DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B 限制性內(nèi)切酶可用于目的基因的獲得C 目的基因須由運載體導入受體細胞D 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶 A 練習 4 有關(guān)基因工程的敘述正確的是 A 限制酶只在獲得目的基因時才用B 重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成C 質(zhì)粒都可作為運載體D 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料 D 練習 5 基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的 在基因操作的基本步驟中 不進行堿基互補配對的步驟是 A 人工合成目的基因B 目的基因與運載體結(jié)合C 將目的基因?qū)胧荏w細胞D 目的基因的檢測和表達 C 練習 6 為了培育節(jié)水高產(chǎn)品種 科學家將大麥中與抗旱節(jié)水有關(guān)的基因?qū)胄←?得到轉(zhuǎn)基因小麥 其水分利用率提高了20 這項技術(shù)的遺傳學原理是A 基因重組B 基因突變C 基因復(fù)制D 基因分離 A 練習 7 利用蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因培育的抗蟲棉是否成功 最好檢測A 是否有抗生素產(chǎn)生B 是否有目的基因表達C 是否有抗蟲的性狀出現(xiàn)D 是否能分離到目的基因 練習 C 8 水母發(fā)光蛋白由236個氨基酸構(gòu)成 其中天冬氨酸 甘氨酸和絲氨酸構(gòu)成發(fā)光環(huán) 現(xiàn)已將這種蛋白質(zhì)的基因作為生物轉(zhuǎn)基因的標記 在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中 這種蛋白質(zhì)的作用是A 促使目的基因?qū)胧荏w細胞B 促使目的基因在受體細胞內(nèi)復(fù)制C 使目的基因容易被檢測出來D 使目的基因容易成功表達 練習 C 9 PCR技術(shù)擴增DNA 需要的條件是 目的基因 引物 四種脫氧核苷酸 DNA聚合酶等 mRNA 核糖體A B C D 鞏固練習 A 10 獲取目的基因的方法有多種 下列不屬于目的基因獲取方法的是 A 從基因組文庫中獲取B 從cDNA文庫中獲取C 從含目的基因生物細胞中獲取D 利用PCR技術(shù)獲取 練習 C 11 下列高科技成果中 根據(jù)基因重組原理進行的是 A 我國科學家袁隆平利用雜交技術(shù)培育出超級水稻 B 我國科學家將蘇云金桿菌的某些基因轉(zhuǎn)移到棉花體內(nèi) 培育出抗蟲棉 C 我國科學家通過返回式衛(wèi)星搭載種子培育出太空椒 D 我國科學家通過體細胞克隆技術(shù)培育出克隆牛 AB 練習 12 有關(guān)基因工程的敘述正確的是 A 限制性內(nèi)切酶只在獲得目的基因時才使用B DNA連接酶可以切斷磷酸二酯鍵C 質(zhì)粒都可以做載體D 基因工程能定向改變生物的性狀 D 練習 13 下圖是利用基因工程辦法生產(chǎn)人白細胞干擾素的基本過程圖 據(jù)圖回答 1 過程需要 酶的參與 2 物質(zhì)是從大腸桿菌分離出的 其化學本質(zhì)是 它必須能在宿主細胞中 3 過程表明目的基因 限制 質(zhì)粒 DNA 穩(wěn)定存在并復(fù)制 成功表達 尋根問底 1 為什么要構(gòu)建基因文庫 直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎 提示 構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一 并不是惟一的方式 如果所需要的目的基因序列已知 就可以直接提取再通過PCR方式直接獲得 也可以通過反轉(zhuǎn)錄 用PCR方式從mRNA中獲得 不一定要構(gòu)建基因文庫 但如果所需要的目的基因的序列完全不知 或只知道目的基因序列的一段 或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因 或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同 或者想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達的基因有什么不同 或者想得到一種生物的全基因組序列 往往就需要構(gòu)建基因文庫 尋根問底 將目的基因直接導入受體細胞不是更簡便嗎 如果這么做 結(jié)果會怎樣 提示 有人采用總DNA注射法進行遺傳轉(zhuǎn)化 即將一個生物中的總DNA提取出來 通過注射或花粉管通道法導入受體植物 沒有進行表達載體的構(gòu)建 這種方法針對性差 完全靠運氣 也無法確定什么基因?qū)肓耸荏w植物 此法目前爭議頗多 嚴格來講不算基因工程 作為基因工程表達載體 只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎 為什么 不可以 因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用 還需要有其他控制元件 如啟動子 終止子和標記基因等 必須構(gòu)建上述元件的主要理由是 1 生物之間進行基因交流 只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達 2 通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子 只將編碼序列導入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄 思考與探究 根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機理 你能分析出不能導入單子葉植物的原因嗎 若將一個抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做 要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株 因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物 要加趨化和誘導的物質(zhì) 一般為乙酰丁香酮等 目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏 趨化性 和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū) 誘導 的基因 使T DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上 利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素 聯(lián)系前面有關(guān)細胞器功能的知識 結(jié)合基因工程操作程序的基本思路 思考一下 若要生產(chǎn)人的糖蛋白 可以用大腸桿菌嗎 有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈 這些糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基存在于真核細胞中 大腸桿菌不存在這兩種細胞器 因此 在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的 珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分 當它的成分異常時 動物有可能患某種疾病 如鐮刀形細胞貧血癥 假如讓你用基因工程的方法 使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的 珠蛋白 想一想 應(yīng)如何進行設(shè)計 1 從小鼠 珠蛋白mRNA反轉(zhuǎn)錄出 珠蛋白基因的編碼序列 cDNA 2 將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子 另外加上抗四環(huán)素的基因 構(gòu)建成一個表達載體 3 將表達載體導入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中 然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌 如果表達載體未進入大腸桿菌中 大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉 如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落 則表明 珠蛋白基因已進入其中 4 培養(yǎng)進入了 珠蛋白基因的大腸桿菌 收集菌體 破碎后從中提取 珠蛋白 3 目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記 4 為了增強目的基因的表達水平 往往還要增加一些其他調(diào)控元件 如增強子等 5 有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位 往往要加上可以標識存在部位的基因 如綠色熒光蛋白基因等 同學們 來學校和回家的路上要注意安全 同學們 來學校和回家的路上要注意安全