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歡迎進入生物課堂 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片斷 分子生物學(xué)研究中最強大的實驗技術(shù)之一 其本質(zhì)是在體外模擬胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過程 美國科學(xué)家穆利斯 K B Mullis 發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎 一 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù) 能以極少量的DNA為模板 在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的 拷貝 廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷 刑偵破案 古生物學(xué) 基因克隆和DNA序列測定等 二 DNA分子的結(jié)構(gòu) 1 基本組成單位 脫氧核苷酸 脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)式 3 5 一個核苷酸上的磷酸基團上的 OH 和另一個核苷酸分子的第三位碳原子上的羥基之間失去一分子水 形成磷酸二脂鍵 即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3 和5 碳原子之間形成磷酸二脂鍵 數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3 5 磷酸二脂鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈 通常將DNA的羥基 OH 末端稱為3 端 而磷酸基團的末端稱為5 端 2 多脫氧核苷酸鏈的形成 多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖 3 DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)特點 DNA分子是由兩條反向平行的 即一條鏈為3 5 另一條鏈為5 3 脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu) 脫氧核糖與磷酸交替連結(jié) 排列在外側(cè) 構(gòu)成基本骨架 堿基排列在鏈的內(nèi)側(cè) 兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結(jié)起來 形成堿基對 堿基對的組成有特定的規(guī)律 即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對 鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對 三 DNA的復(fù)制 2 時期 有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂前的間期 3 場所 細胞核 主 線粒體 葉綠體 4 模板 DNA母鏈 1 概念 由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程 5 原材料 脫氧核苷酸 6 基本條件 酶 ATP 原料 模板 7 復(fù)制過程 DNA的解旋 親代DNA分子利用細胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂 部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈 RNA引物的合成 以單股DNA為模板 在引物酶的作用下合成小段的RNA引物 DNA的生成 以單股的DNA為模板 在DNA聚合酶的作用下 在RNA引物的末端由5 端 3 端合成DNA 邊解旋邊復(fù)制 過程 8 復(fù)制特點 半保留復(fù)制 結(jié)果 9 遵循原則 堿基互補配對原則 10 精確復(fù)制的原因 11 復(fù)制的意義 DNA分子通過復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代 從而保持了遺傳信息的連續(xù)性 規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板 堿基互補配對能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無誤的進行 總結(jié) 胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本體系 打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3 端開始連接脫氧核苷酸 四 PCR 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 1 PCR原理 在80 100 的溫度范圍內(nèi) DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體 雙鏈分開 這個過程稱為變性 當(dāng)溫度緩慢降低后 兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈 PCR利用了DNA的熱變性原理 通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合 現(xiàn)在使用的PCR儀實質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器 變性 復(fù)性 延伸 加熱到90 DNA雙鏈解旋為單鏈 降到50 引物通過堿基互補配對與單鏈DNA結(jié)合 升溫到72 四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下 根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈 2 細胞內(nèi)和細胞外DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別 細胞內(nèi)源引物合成酶細胞內(nèi)源細胞內(nèi)源細胞內(nèi)環(huán)境 外源加入外源加入外源加入外源加入緩沖液 PCR過程需要的引物不是RNA 而是人工合成的DNA單鏈 其長度通常為20 30個脫氧核苷酸 3 細胞內(nèi)復(fù)制和PCR的主要不同點 PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶 而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實現(xiàn)的 4 DNA聚合酶特性 不能從頭合成DNA 只能從DNA的3 端開始延伸DNA鏈 因此 DNA復(fù)制需要引物 5 DNA聚合酶作用過程 當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后 DNA聚合酶就能從引物的3 端開始延伸DNA鏈 DNA的合成方向總是從子鏈的5 端向3 端延伸 高溫解決了打開雙鏈的問題 但又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題 耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活 促成了PCR技術(shù)的自動化 6 TaqDNA聚合酶的應(yīng)用 7 緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì) DNA模板 分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物 四種脫氧核苷酸 耐熱的DNA聚合酶存在于緩沖液中 同時通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行 PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù) 它具有特異 敏感 產(chǎn)率高 快速 簡便 重復(fù)性好 易自動化等特性 8 PCR技術(shù)的特點 五 PCR的反應(yīng)過程 1 PCR的反應(yīng)步驟 PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán) 每次循環(huán)可以分為三個基本步驟 變性 復(fù)性和延伸 變性 模板DNA解旋 模板DNA經(jīng)加熱至900C以上 一定時間后 使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離 使成為單鏈 以便于它與引物結(jié)合 為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備 2 循環(huán)過程 PCR循環(huán)第一步 高溫變性 復(fù)性 退火 低溫復(fù)性 模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后 溫度降到500C左右 引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合 PCR循環(huán)第二步 引物與靶序列退火 延伸 中溫延伸 DNA模板 引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料 以母鏈為模板 按堿基互補配對的原則與半保留復(fù)制的原理 合成一條新的DNA鏈 3 30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量 六 PCR的實驗操作 1 PCR儀 一 設(shè)備及用具 實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器 2 微量離心管 一種薄壁塑料管 總?cè)莘e為0 5ml 3 微量移液器 用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體 其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次 PCR儀 微量離心管 一次性吸液槍頭 調(diào)節(jié)輪 卸槍頭按鈕 推動按鈕 卸槍頭器 微量移液器 二 實驗操作步驟 一 理論上DNA擴增數(shù)目的計算 七 課題成果評價 1 一條DNA 復(fù)制n次 DNA為2n 2 a條DNA 復(fù)制n次 DNA為ax2n 二 實驗中DNA含量的測定原理 可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果 DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰 峰值的大小與DNA的含量有關(guān) 光吸收 波長 nm 260 240 220 280 0 1 0 2 同學(xué)們 來學(xué)校和回家的路上要注意安全 同學(xué)們 來學(xué)校和回家的路上要注意安全